③含乳的飲料

準確取2～5g（精確至0.0001g）樣品，加入1.0mL亞鐵氰化鉀溶液和1.0mL乙酸鋅溶液，搖勻，加水定容至10mL，渦旋混勻，5000r/min離心5min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，備用。

（2）標準曲線的制作

將標準系列溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，分別注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

③試樣溶液的測定

將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，以保留時間定性，同時記錄峰面積，根據(jù)標準曲線得到待測液中3種添加劑的濃度。

定性判斷：試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與標準色譜峰的保留時間一致，變化范圍應(yīng)在（±2.5%）之內(nèi)。待測化合物的定性離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)≥3（S/N≥3），定量離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)≥10（S/N≥10）。

目標化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個母離子和兩個子離子（甜蜜素為一個母離子和一個子離子），且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當?shù)臉藴嗜芤合啾?，其允許偏差不超過規(guī)定的范圍。

式中：x——樣品中待測組分的含量（μg/kg）；

C——測定液中待測組分的濃度（μg/L）；

C₀——空白中待測組分的濃度（μg/L）；

V——定容體積（mL）；

M——樣品稱樣量（g）。

二、結(jié)果與討論

1、流動相選擇

實驗中考察選用0.05%氨水-甲醇、5mmol/L乙酸銨-甲醇、10mmol/L乙酸銨-甲醇作流動相，實驗表明0.05%氨水-甲醇作為流動相三種目標物響應(yīng)最高，10mmol/L乙酸銨-甲醇作流動相三種目標物響應(yīng)最低。圖2為1.0mg/L混合標準溶液在不同流動相中的響應(yīng)值。文獻報道中流動相選用鹽溶液，如10mmol/L乙酸銨、甲酸銨-乙腈，本文所用儀器為WatersAcquityUPLC-XEVOTQD，若使用10mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相，在儀器Intellistart功能中并不能找到目標化合物的MRM，手動優(yōu)化發(fā)現(xiàn)目標化合物MRM響應(yīng)很低。若使用5mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相Intellistart功能中并可以找到目標化合物的MRM，但與使用0.05%氨水-甲醇作為流動相相比，離子響應(yīng)較低，XEVOTQD在負離子模式下，堿性環(huán)境更有利于化合物去氫生成負離子，因而文中選用0.05%氨水-甲醇作為流動相。

2、含乳飲料樣品前處理的優(yōu)化

樣品不經(jīng)凈化處理，基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯，因此實驗中考察用三氯乙酸溶液（1g/L）、PSA分散固相萃取、乙酸鋅-亞鐵氰化鉀凈化樣品。三氯乙酸溶液是很好的蛋白沉淀劑，但三氯乙酸吸電子效應(yīng)明顯，不利于三種目標化合物脫氫電離。PSA固相吸附劑，與NH2相似的吸附劑，有兩個氨基，比氨基柱更強的離子交換能力，弱陰離子交換（水溶性基質(zhì)），用于去除有機酸、色素和金屬離子。用PSA分散固相萃取可以很好的去除飲料中的去除有機酸、色素和金屬離子，但它同時也會吸附部分糖精鈉和安賽蜜（見圖3），因而一般樣品經(jīng)過濾后直接測定糖精鈉與安賽蜜含量，經(jīng)PSA分散固相萃取后過濾測定甜蜜素含量，0.3～0.5gPSA用量可以得到較好的回收率。

2Zn²⁺+［Fe（CN）6］⁴⁺=Zn₂［Fe（CN）6］↓（白色），乙酸鋅與亞鐵氰化鉀反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅沉淀來挾走或吸附干擾物質(zhì)，這種澄清劑除蛋白質(zhì)能力強，但脫色能力差。實驗中考察沉淀劑的用量：分別用乙酸鋅-亞鐵氰化鉀0.5～0.5mL、0.75～0.75mL、1.0～1.0mL、2.0～2.0mL、1.0～2.0mL（物質(zhì)量之比1∶2）和2.0～1.0mL（物質(zhì)量之比4∶1）處理5.0g樣品，實驗表明只有當氰亞鐵酸鋅含量達到0.00075moL時，且按照化學計量反應(yīng)比例加入沉淀劑，三種化合物的回收率才較好（見圖4），但過多的鹽溶液進入UPLC/MS/MS系統(tǒng)會在錐空上沉積，影響電離效率，因而本實驗選用沉淀劑用量為：乙酸鋅0.0002moL，亞鐵氰化鉀0.0001moL。對其他含乳樣品可以參考本實驗選擇合適的沉淀劑用量。

3、方法線性方程、檢出限和定量限

3種化合物工作標準曲線見表3，安賽蜜和甜蜜素在5～200μg/L范圍內(nèi)，糖精在20～200μg/L范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.995，20μg/L和200μg/L標準溶液連續(xù)進樣6次，精密度為8.6%和5.4%，方法檢出限（S/N=3）為0.2～10μg/kg，方法定量限（S/N=10）為0.6～30μg/kg，見表3。

4、樣品加標回收實驗

3種化合物在自制奶茶中三個級別添加量的回收率為78.9%～95.7%，在某品牌果茶中三個級別添加量的回收率為80%～102%，回收良好。見表4。

5、樣品檢測結(jié)果

測定5份定型包裝飲料與5份自制奶茶均未檢出3種添加劑。

三、結(jié)論

本文建立UPLC/MS/MS法測定飲料品中的甜蜜素、糖精鈉和安賽蜜的檢測方法，即一般樣品經(jīng)過濾處理，檢測樣品中的糖精和安賽蜜的含量；經(jīng)PSA分散式固相萃取后，檢測樣品中甜蜜素含量；含乳樣品經(jīng)乙酸鋅-亞鐵氰化鉀去蛋白處理；用0.05%氨水-甲醇做流動相，負離子模式采集。與其他分析方法相比，操作簡單，檢出限低，重現(xiàn)性好，回收率良好，干擾小，避免甜蜜素衍生反應(yīng)，消除樣品基體抑制效應(yīng)，適用于飲料樣品中3種添加劑的測定。

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