2結(jié)果與討論

2.1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1提取試劑的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了4類獸藥在乙腈和甲醇中的提取效果。結(jié)果表明，甲醇提取的樣品中蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)較多，后續(xù)凈化難度增加且對(duì)目標(biāo)物有較大干擾，大多數(shù)藥物的回收率較差；而乙腈滲透性強(qiáng)，對(duì)多數(shù)目標(biāo)化合物有較高的提取率，且沉淀蛋白質(zhì)效果較好，可以減少?gòu)?qiáng)極性雜質(zhì)和弱極性雜質(zhì)的提取，因此選擇乙腈為提取試劑。

2.1.2樣品水解液的優(yōu)化

磺胺類、喹諾酮類藥物在生物體內(nèi)易與蛋白結(jié)合產(chǎn)生較強(qiáng)的結(jié)合力，影響藥物的提取效率。若將乙腈直接加入高蛋白樣品中會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)急劇變性凝聚，使提取液不能充分接觸藥物，提取效率偏低。但在加入乙腈前先加入一定體積和濃度的酸或堿溶液，可破壞這一結(jié)合力和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促使結(jié)合態(tài)藥物解離為游離態(tài)，充分釋放到提取液中，且水解后樣品含水量增加還可減緩蛋白質(zhì)的變性速度，增大提取試劑與藥物的接觸面積，提高藥物的提取效率；另外，酸、堿還可抑制化合物酸、堿基團(tuán)的解離，提高其轉(zhuǎn)移到乙腈層中的效率。實(shí)驗(yàn)考察了向樣品中加入相同濃度稀鹽酸、氨水、甲酸、磷酸氫二鉀溶液水解后藥物的提取效果。結(jié)果表明，堿溶液水解的雞蛋樣品乳化現(xiàn)象較嚴(yán)重，乙腈與基質(zhì)及水相難以分離；而酸水解的分層較好，其中加鹽酸的樣品中大多數(shù)藥物的回收率更高，對(duì)鹽酸濃度和體積優(yōu)化后，確定以5mL2mol/L鹽酸水解樣品。

2.1.3鹽析試劑的優(yōu)化

由于水解樣品時(shí)帶入大量水而影響提取試劑的濃縮效率。本實(shí)驗(yàn)考察了向提取液中加入過(guò)量的無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水硫酸鎂、碳酸鈉、碳酸氫鈉及氯化鈉以除去水。結(jié)果表明，除氯化鈉外，其余4種均不能使乙腈和水分層，無(wú)水硫酸鈉及無(wú)水硫酸鎂在本實(shí)驗(yàn)中的使用量不僅不能將水全部去除，還使部分獸藥被吸附而降低回收率。而氯化鈉的鹽析作用可促使水相中的藥物大量轉(zhuǎn)移到乙腈層中，同時(shí)提取液中大量蛋白質(zhì)沉淀于水相，避免了提取液濃縮時(shí)產(chǎn)生泡沫而溢出的損失。因此，向提取液中加入過(guò)量氯化鈉至飽和(約7～9g)，待乙腈和水分層后取出乙腈層再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.4提取次數(shù)的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了雞蛋、雞肉樣品水解后，每次加入15mL乙腈分別提取1、2、3次后各藥物的回收率，結(jié)果列于表2?？梢?jiàn)，提取1次部分藥物及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的提取效率有較大差異，部分藥物超出獸藥殘留對(duì)回收率(70%～120%)的要求；提取2次的回收率最好；提取3次的干擾峰增多。因此，選擇每次加入15mL乙腈重復(fù)提取2次。

2.1.5凈化試劑的優(yōu)化

提取液濃縮至干后，殘留物中有大量油狀物，因此先于提取液中加入8～10mL正己烷除脂后測(cè)定。結(jié)果表明，大多數(shù)藥物的回收率高于除脂前，且靈敏度增強(qiáng)，但磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、洛美沙星和培氟沙星的回收率較差。若使用8～10mL環(huán)己烷-正己烷溶液，則磺胺間甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉的回收率在70%～120%之內(nèi)，其余藥物的回收率也很好。因此，選擇8～10mL環(huán)己烷-正己烷溶液去除提取液中的脂肪。

此外，部分氯化鈉溶于乙腈中，易對(duì)儀器造成污染。由于氯化鈉在乙酸乙酯中的溶解度較小，因此，將樣品提取液濃縮至干后，加入2mL含不同濃度甲酸的乙酸乙酯溶解、過(guò)濾，考察對(duì)氯化鈉去除效果及藥物回收率的影響。結(jié)果表明，乙酸乙酯溶解后均有大量氯化鈉析出，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，去除氯化鈉后大多數(shù)藥物的回收率高于去除前，尤其是洛美沙星和培氟沙星，其中以0.2%甲酸-乙酸乙酯溶解的樣品最好。通過(guò)計(jì)算樣品提取液去除氯化鈉前、后的藥物基質(zhì)效應(yīng)(ME)(ME=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100%)發(fā)現(xiàn)，去除氯化鈉后部分藥物基質(zhì)效應(yīng)大大減弱，示于圖1。由此推測(cè)，氯化鈉對(duì)藥物回收率有較大影響，選擇0.2%甲酸-乙酸乙酯溶液溶解殘留物去除氯化鈉。

2.1.6凈化方式的優(yōu)化

樣品中含有色素、糖、有機(jī)酸、礦物質(zhì)等多種雜質(zhì)，會(huì)減弱色譜柱的性能，影響儀器使用壽命。PSA可有效吸附糖類、色素、有機(jī)酸，C18可吸附脂肪和一些礦物質(zhì)等，因此，實(shí)驗(yàn)將C18與PSA混合作為吸附劑，分別采用分散固相萃取法和改良分散固相萃取法(按1.4.2節(jié)操作)對(duì)經(jīng)前兩步凈化后的提取液再凈化。結(jié)果表明，由于改良分散固相萃取法中待凈化液與填料接觸更加充分，去除雜質(zhì)效果更好，回收率較高，大多集中在80%～110%范圍內(nèi)。最終選擇C18為30mg，PSA為60mg為吸附劑的改良分散固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

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