1引言

植物真菌病害是造成農(nóng)產(chǎn)品損耗的主要原因之一，在實(shí)際生產(chǎn)中造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。病原菌侵染植株后，使農(nóng)作物局部或整株感病，影響作物生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)造成植株死亡，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降。多數(shù)病原菌不僅能在作物生長(zhǎng)過(guò)程中影響植株?duì)顟B(tài)，還在農(nóng)產(chǎn)品的運(yùn)輸過(guò)程中造成產(chǎn)品腐爛變質(zhì)，是造成果蔬運(yùn)輸損耗的主要原因。此外，部分真菌病原菌能夠分泌真菌毒素，食用含有真菌毒素的果蔬能夠?qū)е禄セ蛘T發(fā)癌癥，威脅人類健康。如多種鏈格孢產(chǎn)生的鏈格孢毒素以及多種曲霉產(chǎn)生的伏馬霉素B。

幾丁質(zhì)，是由N-乙?；?D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）單體通過(guò)β-1，4-糖苷鍵連接的聚合物，也是病原真菌細(xì)胞壁的主要成分。在絲狀真菌中，幾丁質(zhì)和其他葡聚糖含量占細(xì)胞壁成分的70%以上，在部分酵母中，幾丁質(zhì)含量甚至達(dá)到細(xì)胞干重的10%～20%。幾丁質(zhì)酶可以通過(guò)外切和/或內(nèi)切水解酶作用將幾丁質(zhì)裂解為GlcNAc或GlcNAc的可溶性寡聚體。因此，以幾丁質(zhì)作為分子靶標(biāo)，通過(guò)幾丁質(zhì)酶的水解作用來(lái)實(shí)現(xiàn)植物病害防治是植物病害控制的有效途徑。而生物防治因子分泌細(xì)胞壁裂解酶，裂解病原真菌細(xì)胞壁，也成為生物防治微生物拮抗植物病原真菌的主要機(jī)制之一。

煙管菌（Bjerkanderaadusta）屬于非褶菌目，多孔菌科，煙管菌屬。目前，對(duì)于煙管菌（Bjerkanderaadusta）的研究主要集中在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，但仍不乏煙管菌對(duì)植物真菌病害治理的研究報(bào)道。1982年，Dománski發(fā)現(xiàn)煙管菌能夠抑制櫟樹（Quercusrobur）褐腐病的發(fā)生。2011年，Bak等研究發(fā)現(xiàn)了煙管菌對(duì)歐美黑楊（Populuseuramericana）干腐病具有防控能力；2015年，汪華等人篩選出一株對(duì)水稻紋枯病菌或瓜亡革菌（Thanatephoruscucumeris）、大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）、茄科羅爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）等引起的植物病害具有很好防治效果的煙管菌M-1；2017年，Zhang等人研究發(fā)現(xiàn)煙管菌能夠有效的抑制西瓜蔓枯病菌（Didymellabryoniae），并在2018年首次探究了煙管菌對(duì)核盤菌的抑制作用及其對(duì)油菜菌核病（Sclerotiniasclerotiorum）的防治效果。但目前，仍然缺乏煙管菌生物防治機(jī)制研究。本研究結(jié)合抗病效果和RT-qPCR分析，首次從煙管菌中篩選并克隆出一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，并通過(guò)外源表達(dá)證明了該酶的抗真菌活性。推測(cè)該基因是煙管菌發(fā)揮生防作用過(guò)程中的細(xì)胞壁裂解酶基因。

2材料與方法

2.1材料

本氏煙（Nicotianabenthamiana）。

煙管菌（Bjerkanderaadusta）菌株BK-1從四川省馬爾康市土壤中獲得，保藏于本實(shí)驗(yàn)室，ITS序列號(hào)為MW182414（NCBI）。鏈格孢（Alternariaalternata）菌株CD-1，鏈格孢蘋果專化型（Alternariaalternataf.sp.mali）L-1，細(xì)極鏈格孢（Alternariatenuissima）SCAU-1和灰葡萄孢（Botrytiscinerea）DY-1均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）（BNCCNO.143078），茄鏈格孢（Alternariasolani）（BNCCNO.337910）購(gòu)自北納生物（BeNaCultureCollection，BNCC）。

PCR引物見表1及表2。

2.2方法

2.2.1煙管菌抗病能力分析

將灰葡萄孢，鏈格孢和細(xì)極鏈格孢轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中25℃活化培養(yǎng)7d，使用直徑為5mm的打孔器切取菌絲瓊脂塊作為接種物；煙管菌活化培養(yǎng)7d后，將5個(gè)直徑為5mm的煙管菌菌絲瓊脂塊接種至液體的100mLPDB培養(yǎng)基中25℃，180r/min活化培養(yǎng)7d后使用粉碎機(jī)打碎，制成煙管菌菌絲懸液作為抗菌液（AntiL）備用。

離體實(shí)驗(yàn)：從生長(zhǎng)30d的煙草植株上剪取健康的煙草葉片流水沖洗10min，使用保鮮膜封住葉柄切口處，放置于無(wú)菌水浸濕的三層濾紙上，在主葉脈兩側(cè)對(duì)稱位置分別涂抹50μL無(wú)菌水和煙管菌菌絲懸液后接種病原菌菌絲瓊脂塊作為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6重復(fù)。再將葉片和濾紙放入上層開口的塑料盒中，上層使用保鮮膜封口保持盒內(nèi)濕潤(rùn)。將其置于溫室內(nèi)（23℃，16h光照；18℃，8h黑暗），保持48h（細(xì)極鏈格孢侵染96h）后對(duì)煙草葉片進(jìn)行拍照記錄。

活體實(shí)驗(yàn)：選取健康的煙草植株，將從上至下第4片葉片作為接種對(duì)象，接種方法同離體實(shí)驗(yàn)。將接種后的植株放置在密閉，透光且濕潤(rùn)的育苗盆內(nèi)，溫室培養(yǎng)48h（細(xì)極鏈格孢侵染96h）后拍照記錄。

上述實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)兩次，并使用ImageJ進(jìn)行葉片感病面積統(tǒng)計(jì)。

2.2.2生物信息學(xué)分析

參考該菌株基因組相關(guān)信息（NCBIBioProjectID：PRJNA667319），使用SignalPv5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)其幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-糖苷酶基因進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)幾丁質(zhì)酶的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)。

2.2.3對(duì)峙培養(yǎng)及RT-qPCR分析

將6種病原真菌和煙管菌接種到PDA培養(yǎng)基中，25℃避光條件下活化培養(yǎng)5d，使用打孔器取各菌落邊緣處直徑為5mm的菌塊。分別將煙管菌和一種病原菌接種到新的PDA培養(yǎng)基中，各距離平板邊緣2cm，并使兩菌塊保持在同一直徑線上25℃避光培養(yǎng)。

使用真菌RNA快速抽提試劑盒（生工），提取對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中接種后第6d相互接觸區(qū)域菌絲的RNA，使用EasyScript©One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix（全式金）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA.以cDNA為模板，以18SrRNA作為參考基因，使用2×T5FastqPCRMix（SYBRGreenII）試劑盒（擎科）對(duì)預(yù)測(cè)具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-糖苷酶基因進(jìn)行表達(dá)量測(cè)定。

2.2.4煙管菌幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB克隆

使用高保真酶1-5TM2×Hight-FidelityMasterMix（MCLAB）擴(kuò)增去除信號(hào)肽區(qū)段的幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB-T，并在C端添加6×His蛋白純化標(biāo)簽。以煙管菌cDNA為初始模板，后續(xù)PCR過(guò)程依次使用上一步擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，得到目的片段BaCHIB-T，具體引物如下：①.BaCHIB-Cl-F/R；②.BaCHIB-Cl-F和His1-R；③.BaCHIB-Cl-F和His2-R；④.EcoRⅠ-T-F和NotⅠ-R。

使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotI處理載體pPIC9K.利用同源重組試劑盒（諾唯贊）將BaCHIB-T與線性化的載體同源重組得到重組載體pPIC9K-BaCHIB-T（圖1），測(cè)序正確的表達(dá)載體使用限制性內(nèi)切酶salⅠ線性化，醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母（Pichiapastoris）GS115菌株。

2.2.5重組蛋白的表達(dá)和純化及抗真菌活性

蛋白的表達(dá)和純化按照Deng等的方法進(jìn)行，并進(jìn)行改進(jìn)。重組載體的表達(dá)菌株經(jīng)0.5%的甲醇誘導(dǎo)5d，相同處理的空載轉(zhuǎn)化菌株用于對(duì)照組。依次使用含有80，100，120，140mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗脫與柱結(jié)合的目標(biāo)蛋白。目的條帶經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)。幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定使用幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)試劑盒（索萊寶）。

純化后的重組蛋白，濃度調(diào)整為200μg/mL進(jìn)行抗真菌活性檢測(cè)。從活化5d的鏈格孢，茄鏈格孢和灰葡萄孢的平板邊緣切取兩塊邊長(zhǎng)約為5～10mm的正方形菌絲瓊脂塊，并將其置于2mL離心管中。每管加入400μL純化蛋白溶液作為實(shí)驗(yàn)組，等量蛋白洗脫液作為對(duì)照組25℃暗培養(yǎng)48h后，觀察菌絲生長(zhǎng)狀況。

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