近年來，除食品中轉(zhuǎn)基因成分的安全性、產(chǎn)品標(biāo)示問題外，食品生產(chǎn)貯藏過程中微生物污染導(dǎo)致的食源性疾病及食品成分摻假等食品安全事件也受到人們越來越多的關(guān)注，傳統(tǒng)方法難以滿足不斷提高的快速檢測要求，而精準(zhǔn)、快速、靈敏、穩(wěn)定的數(shù)字PCR技術(shù)則為食品相關(guān)檢測提供了新的思路和方法。國內(nèi)外學(xué)者研究了數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物鑒別定量、肉制品中摻假種類及含景分析、食品致病菌檢測中的應(yīng)用，建立高效可行的檢測方法并填補(bǔ)了相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的空白。本文回顧總結(jié)了數(shù)字PCR技術(shù)在食品轉(zhuǎn)基因成分、食品源性成分、微生物檢測中的應(yīng)用，并對其存在的問題進(jìn)行了分析。

1數(shù)字PCR概述

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(P01ymnerasechainreaction，PCR)是分子生物學(xué)研究中使用較多的方法，主要有普通PCR、實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT—PCR)等。其中qPCR是目前常用的定性及定量基兇分析技術(shù)，但該方法需要使用標(biāo)準(zhǔn)品、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并利用循環(huán)閾值對結(jié)果進(jìn)行分析，小僅增大了工作量和檢測成本，在實(shí)際檢測過程也會造成一定誤差。

上世紀(jì)90年代Sykes等將PCR技術(shù)、樣品稀釋、泊松分布計算方法結(jié)合，對白血病克隆的重排免疫球蛋白重鏈(IgH)基因進(jìn)行定量，這是數(shù)字PCR技術(shù)首次出現(xiàn)在大眾視野。1999年，VogelsLein等稀釋分離單個分子后分別擴(kuò)增，然后使用熒光探針分析每種產(chǎn)物是否存在突變，檢測結(jié)腸直腸癌患者糞便中突變的ras基因來證明了其可行性，并首次提出了數(shù)字PCR的概念：數(shù)字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一種針對單分子目標(biāo)DNA擴(kuò)增的絕對定量技術(shù)。

數(shù)字PCR工作原理在于將被標(biāo)記的樣品分割形成大量獨(dú)立的反應(yīng)體系，每個獨(dú)立反應(yīng)體系中小含或含有一個及以上待測靶標(biāo)序列，含有待測靶標(biāo)序列的為陽性，不含待測靶標(biāo)序列的為陰性。在每個獨(dú)立反應(yīng)體系中對被標(biāo)記的樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)后，含有待測基因靶標(biāo)的反應(yīng)體系中可檢測到熒光信號，不含待測基因靶標(biāo)時沒有信號積累，讀取陰性、陽性微滴的數(shù)量后傳至數(shù)據(jù)處理軟件得到最終結(jié)果。與qPCR相比，數(shù)字PCR無需標(biāo)準(zhǔn)品也不借助循環(huán)閾值進(jìn)行分析，一定程度上彌補(bǔ)了qPCR的不足。

2011年后，數(shù)字PCR商業(yè)化迅速發(fā)展，其中兩種類型的數(shù)字PCR儀在研究中使用較多，一種是基于高密度微孔芯片的數(shù)字PCR(ccPCR)，如LifeTechnologies鈷牌的QuanLStudioTM3DDigiLalPCRSystem，每張芯片上含有20000個微孔，滿足檢測要求。另一種是利用油包水液滴作為載體的數(shù)字PCR(DropletdigitalPCR，ddPCR)，如Raindance公司的Raindrop、Bio-Rad公司的QX200^TM及QX100等，其中Bio-Rad公司的QX200TM是現(xiàn)階段最領(lǐng)先的數(shù)字PCR系統(tǒng)。

數(shù)字PCR在定量分析過程中無需借助標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且準(zhǔn)確度高，靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)方法及qPCR等方法，可達(dá)到qPCR方法的10倍甚至更高；在一定檢測范同內(nèi)，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)偏差小，準(zhǔn)確度高，且不同實(shí)驗(yàn)室或檢測機(jī)構(gòu)問重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果波動小。其作為分子定量檢測中最可靠的方法之一，近年來在拷貝數(shù)定景、微生物檢測、檢驗(yàn)檢疫、醫(yī)學(xué)診斷研究、基因檢測、資源環(huán)境科學(xué)。等領(lǐng)域均有研究，在食品相關(guān)檢測方面也有著巨大潛力。

2食品轉(zhuǎn)基因成分分析

目前全球范圍內(nèi)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因食品中，以能夠滿足營養(yǎng)要求且能夠更好適應(yīng)栽培條件的轉(zhuǎn)基因植物及以其為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品為主，市售轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種類與數(shù)量快速增加，其安全性、標(biāo)識及市場管理問題等都亟需解決。國內(nèi)外現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中對轉(zhuǎn)基因作物及相關(guān)產(chǎn)品的檢測主要采用基于外源核酸序列的qPCR技術(shù)，為了更加快速準(zhǔn)確檢測轉(zhuǎn)基因成分，諸多研究者利用數(shù)字PCR技術(shù)對不同植物轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法進(jìn)行研究。

MorisseL等最早建立了利用數(shù)字PCR同時檢種轉(zhuǎn)基因玉米基因拷貝的絕對數(shù)量的方法，得測定的靈敏度及檢測范圍明顯優(yōu)于cdPCR及qPCR方法，證實(shí)了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因作物檢測中的行性及優(yōu)勢。朱鵬宇、繆青梅等研究者分別建立雙重ddPCR檢測方法對轉(zhuǎn)基因水稻Bt汕優(yōu)63和抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基兇水稻G6H1進(jìn)行研究，樣品中轉(zhuǎn)成分占總質(zhì)量0．5％時也可得到精確結(jié)果。

Deng等對水稻的不同基因進(jìn)行了評估和對比，基于SPS、RBE4和ppi-PPF基因建立的ddPCR系統(tǒng)精確可靠，絕對定量檢測限(LimitofQuantitation，LOQ)為10～20拷貝／反應(yīng)，可以重復(fù)定量并精確地在LOQ之上對水稻的三個內(nèi)源基因進(jìn)行定量，含量低至0.1％時比采用相同探針和引物進(jìn)行檢測的qPCR體系更為準(zhǔn)確。于曉帆等用轉(zhuǎn)基因大豆DAS-44406-6的5’端邊界序列及l(fā)ecin流基因，對其定量檢測(總DNA模板濃度為50ng／反應(yīng)時)，相對靈敏度檢測方法能對轉(zhuǎn)基岡大豆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的樣品準(zhǔn)確定量；絕對靈敏度檢測限可達(dá)到模板DNA質(zhì)量濃度0．01ng/μL。此外還可利用特殊外源基因及內(nèi)參基因設(shè)計引物建立dPCR方法對油菜、土豆、等轉(zhuǎn)基因作物及油類產(chǎn)品進(jìn)行研究，最低檢測限可達(dá)到5個拷貝以下，絕對定量范圍均優(yōu)于qPCR方法。

在對dPCR方法檢測限、靈敏度的研究基礎(chǔ)上，Wang等將轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1制成的米餅采用烘焙、油炸等不同方法處理后進(jìn)行分析，結(jié)果表明，ddPCR方法比qPCR方法更為靈敏，也不易受到加工過程中所產(chǎn)生的PCR抑制劑的影響，對深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的定量更為穩(wěn)定和準(zhǔn)確。Bogozalec等對不同復(fù)雜基質(zhì)飼料中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測，得到的結(jié)果表明數(shù)字PCR技術(shù)可以檢測濃度較高的樣品，而使用qPCR方法則需稀釋180倍。當(dāng)樣品中有較高濃度色素、酸性物質(zhì)、重金屬等物質(zhì)及其他潛在抑制劑時，數(shù)字PCR方法的檢測結(jié)果更準(zhǔn)確，避免了可能存在的“假陰性”現(xiàn)象，從而對深加工食品及復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行檢測與定量，對于轉(zhuǎn)基因作物研究、市場監(jiān)督管理及轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識規(guī)范化進(jìn)程具有重要價值。此外，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中的已有的qPCR檢測方法中所采用的引物、探針可轉(zhuǎn)移至數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)中，具有較好的替代性，并且在cdPCR及ddPCR問的一致性及通用性較好。

日前對轉(zhuǎn)基因作物成分進(jìn)行鑒定時，雙重ddPCR及單重ddPCR方法的選擇存在一定爭議，兩種方法的穩(wěn)定性及檢測限均優(yōu)于qPCR，部分研究表明雙重PCR方法的檢測限略高于單重PCR，但其標(biāo)準(zhǔn)偏差較小且可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料和檢測時間，因此需要根據(jù)不同檢測靶標(biāo)及引物、探針進(jìn)行對比選擇。有研究者建立了多重數(shù)字PCR檢測方法，同時檢測6、7、11個品系的轉(zhuǎn)基因大豆，能夠節(jié)約大最成本及時間，為同一物種不同轉(zhuǎn)基因品系的快速檢測提供了新的思路。此外，由于轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品安全性問題爭議較大，大部分轉(zhuǎn)基因動物主要用于藥物生產(chǎn)或作為生物反應(yīng)器，僅2015年美國FDA批準(zhǔn)上市了轉(zhuǎn)基因三文魚，國內(nèi)尚無轉(zhuǎn)基因動物批準(zhǔn)上市。有研究者對轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因山羊的數(shù)字PCR檢測方法進(jìn)行了研究，證實(shí)了其在轉(zhuǎn)基因動物成分外源基因拷貝數(shù)檢測中的可行性，但在轉(zhuǎn)基因動物為原料的轉(zhuǎn)基因食品中尚無相關(guān)報道。對于轉(zhuǎn)基因微生物而言，有研究者利用數(shù)字PCR建立基因拷貝數(shù)與木聚糖酶活力的關(guān)系從而篩選高產(chǎn)木聚糖酶釀酒酵母，并無直接對食品中轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)行的研究報道。轉(zhuǎn)基因微生物其在食品中的作用主要是生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物如酶制劑、食品添加劑等，近年來有發(fā)酵產(chǎn)物中出現(xiàn)未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因微生物的食品安全事件發(fā)生，已有研究者使用PCR方法及高通量測序方法對發(fā)酵產(chǎn)物中的轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)行檢測，因此在未來檢測中可考慮使用數(shù)字PCR方法對產(chǎn)物中的轉(zhuǎn)基兇微生物進(jìn)行鑒別及定量，為轉(zhuǎn)基因食品安全性評價提供更多可能。

聲明：本文所用圖片、文字來源《食品工業(yè)科技》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：除草劑，免疫球蛋白，PCR，木聚糖