1.7RNA抽提和基因表達分析

抽提擬南芥生長20d的葉片RNA進行RT-PCR的基因表達量檢測。RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR等程序詳見Fan等的方法BrCLV3和內(nèi)參基因18SrRNA的表達檢測引物對分別為DXP109/DXP129和18SrRNAF/R，序列詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 多室白菜型油菜srb的角果形態(tài)分析

對多室白菜型油菜srb的花器官和角果變異進行觀察和分析發(fā)現(xiàn),其花器官數(shù)目變異與多室黃籽沙遜ml4類似,即：花萼和花瓣等花器官數(shù)目正常；雄蕊數(shù)目基本正常，但在極少數(shù)花中可以觀察到7個(圖1-a～j)；雌蕊相對于WT明顯增粗。srb的角果多室性狀遺傳穩(wěn)定，單株多室角果比例94.7%～100.0%，平均為97.9%，每角果具有3～4個心皮(平均3.5個心皮)。多室角果平均長、寬和厚分別為37.0、6.4和3.8mm；較兩室角果顯得短而粗。

對子房進行石蠟切片觀察，WT材料的子房為兩室，是由2個心皮相對發(fā)育成一個完整的假隔膜，將心皮分割成2個腔室，假隔膜兩側(cè)分別著生1列種子；srb的三室子房則由3個心皮向中間發(fā)育形成“Y”字型假隔膜，將角果分割成3個腔室，假隔膜上著生3列種子，果皮分為3瓣(圖1-x)；在srb和ml4的四心皮子房內(nèi)，2個近乎平行排列的假隔膜將子房內(nèi)腔分隔成3個腔室，中間的腔室比兩側(cè)的腔室大，中間的腔室著生2排胚珠，而兩側(cè)的腔室各著生1排胚珠，其假隔膜的橫切面呈“Ⅱ”型(圖1-y)。

2.2 白菜型油菜srb多室性狀的遺傳分析

為確定srb中多室性狀的遺傳規(guī)律，將其與兩室白菜型油菜WT進行正反交，F(xiàn)₁單株全部表現(xiàn)為兩室，表明srb中的多室性狀由隱性核基因控制，且無細胞質(zhì)效應(yīng)(表2)。在F₂分離群體中，兩室表型單株(78株)與多室表型單株(23株)符合3∶1的分離比(χ2=0.27，P＞0.05)。表明srb中的多室性狀受1對隱性核基因控制。

為確定srb中的多室基因是否與我們前期克隆的多室基因Brclv3相同，進一步將srb與ml4進行等位測驗發(fā)現(xiàn)，它們的正反交F1和F2分離群體的所有單株全部表現(xiàn)為多室(表2)。表明srb中的多室基因與ml4中的多室基因等位,因此它們的多室性狀可能均由BrCLV3基因的突變所導(dǎo)致。

2.3 白菜型油菜srb中多室候選基因BrCLV3的克隆與序列分析

我們對srb中的BrCLV3等位基因的編碼區(qū)、2.3kb的啟動子區(qū)和2.5kb的3'端側(cè)翼序列進行比較測序。與WT中的BrCLV3序列比對分析，共發(fā)現(xiàn)3處堿基序列變異(圖2-a)。其中，位于3'端的SNP差異和第2個內(nèi)含子中ATAT插入/缺失差異都不會引起該基因蛋白序列的改變,而位于第3個外顯子中的C/G單核苷酸突變可導(dǎo)致編碼蛋白的1個氨基酸替換。進一步比較ml4、srb和Chiifu-401(已發(fā)表基因組序列的白菜，兩室表型)之間的氨基酸序列差異發(fā)現(xiàn),該突變氨基酸位于CLEmotif的第12位，由組氨酸突變成天冬氨酸，將其命名為Brclv3_Asp12；它與前期在ml4中發(fā)現(xiàn)的CLEmotif上的堿基變異不同，因此Brclv3_Asp12是一個新的等位突變,可引起CLV3多肽信號的序列突變(圖2-b)。在擬南芥中,CLEmotif是CLV3多肽信號分子的重要功能域,由12個保守的氨基酸組成,其中第12位組氨酸對于維持莖頂端分生組織的大小至關(guān)重要。因此，本研究新發(fā)現(xiàn)的第12位His-to-Asp氨基酸替換可能影響B(tài)rCLV3基因的正常功能發(fā)揮，從而影響角果的正常發(fā)育。

2.4 Brclv3Asp12等位基因特異的SNP標記在分離群體中的表型共分離驗證

針對Brclv3_Asp12中的C/G單核苷酸變異開發(fā)了特異性的SNP標記，并對srb×WT雜交產(chǎn)生的F2分離群體進行了BrCLV3基因型的鑒定。結(jié)果表明，BrCLV3純合基因型(AA)單株都為兩室角果表型,Brclv3_Asp12純合基因型單株(aa)都為多室角果表型，雜合基因型單株(Aa)表現(xiàn)為兩室或近乎兩室角果表型(圖3)；3種基因型單株的比例(AA∶Aa∶aa)符合1∶2∶1的分離比(χ2=0.80，P＞0.05)。該結(jié)果證實Brclv3_Asp12中的C/G變異與多室表型共分離，表明該SNP變異可能是引起srb中多室角果產(chǎn)生的原因。

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