過氧化氫酶(CAT)為含鐵卟啉的結(jié)合酶，是一種廣泛存在的抗氧化酶，能清除食品、食品添加劑和配料在消毒滅菌、漂白、加工后產(chǎn)生或殘留的過氧化氫，也能清除奶制品等食品在紫外線照射時(shí)產(chǎn)生的過氧化氫造成的異味，因此測定CAT活性在食品檢驗(yàn)領(lǐng)域具有重要意義。酶的活性一般通過底物的變化來測定，而酶促反應(yīng)具有高度特異、高效、不穩(wěn)定和可調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，因此測定CAT活性的方法多種多樣。高錳酸鉀滴定法因所用設(shè)備簡單，作為國家標(biāo)準(zhǔn)和教學(xué)實(shí)驗(yàn)一直被使用，但高錳酸鉀不穩(wěn)定，試劑溶液標(biāo)定難，保存難，滴定過程中不可避免地存在較大的人為判斷誤差。當(dāng)前化學(xué)動力學(xué)光度法成為一大亮點(diǎn)，董等以二苯胺磺酸鈉為底物完成CAT顯色動力光度法測定，但顯色靈敏度有限，H₂O₂表觀摩爾吸光系數(shù)ε＜5.0×10²L／(mol·cm)。本文以碘量法為基礎(chǔ)，構(gòu)建碘化鉀-淀粉顯色光度法測定CAT活性的新體系。在硫酸介質(zhì)中，雙氧水氧化碘化鉀生成碘，碘與淀粉快速反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色，顯色液在600nm波長處有最大吸收峰。CAT催化H₂0₂分解，通過CAT加入前后吸光度變化值實(shí)現(xiàn)酶活性測定。該方法簡單，原理清晰，耗材少，相對高錳酸鉀滴定法，檢測限更低，非常適合于生物樣品微量CAT活性分析。本實(shí)驗(yàn)用μtmol／mL(U／mL)來表示酶液的酶活性，即lmL過氧化氫酶溶液所消耗過氧化氫物質(zhì)的量(μm01)。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1、儀器與試劑

7230G型可見分光光度計(jì)(上海公司)；分析天平(0.1mg，上海天平儀器廠)。

CAT標(biāo)準(zhǔn)品(上海鼓臣生物技術(shù)有限公司)儲備液：配制濃度lmg／mL(活性約為5000U／mL)，碘量法標(biāo)定；CAT工作液：0.1U／mL(使用前由儲備液稀釋)；H₂0₂基質(zhì)液：1μmol／mL(取0.6mL，3％H202稀釋至500mL)；0.1mol／LH₂S0₄溶液；0.01mol／L碘化鉀溶液；5g／L淀粉液；0.1mol／L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)。

2、測定方法

取50ml容量瓶一只，加入CAT樣液(酶活性小于2U／mL)1.00mE、H₂0₂基質(zhì)液2.00mL，25℃水浴反應(yīng)30min后立即加入1.5mL硫酸終止反應(yīng)，加碘化鉀5mL，60℃水浴加熱40min，冷卻，加淀粉3mL，定容，以蒸餾水作參比液，在波長600nm處測吸光度A，同時(shí)完成酶空白試驗(yàn)吸光度A₀測定，根據(jù)△A(△A=A₀一A)確定過氧化氫酶活性E。

二、結(jié)果討論

1、吸收光譜與最大吸收波長

不同體系吸收光譜見圖1。淀粉與碘化鉀溶液在可見光區(qū)無吸收峰(圖1曲線1)；淀粉、碘化鉀與過氧化氫溶液中，過氧化氫氧化碘化鉀，淀粉溶液呈藍(lán)色，600nm處有最大吸收(圖1曲線3)，峰形尖銳，峰值較高，H₂O₂表觀摩爾吸光系數(shù)ε₆₀₀=2.79×10⁴L／(mol·cm)；加入CAT后，顯色受抑制(圖1曲線2)，但峰位未發(fā)生改變，這說明反應(yīng)僅存在于過氧化氫與碘化鉀之間，顯色程度與過氧化氫含量有關(guān)。實(shí)驗(yàn)選取600nm作測定波長。

2、碘化鉀用量影響

僅針對非酶體系(E=0U／mL)，單純考察了碘化鉀用量影響。結(jié)果表明，A隨碘化鉀體積增大，在0～3mL之間，增幅較快，大量的碘化鉀被氧化；在3～5mL之間，增幅放緩，這時(shí)的碘化鉀主要作為助溶劑，I₂是非極性分子，水溶性差，過量碘化鉀促使碘合離子形成(I₂+I^-=I^-₃)，溶解能力增強(qiáng)。顯然，過量碘化鉀有效改善了顯色環(huán)境，5mL時(shí)A恒定不變。實(shí)驗(yàn)選擇5mL碘化鉀。

3、淀粉用量

用該方法取50ml容量瓶一只，加入CAT樣液(酶活性小于2U／mL)1.00mE、H₂0₂基質(zhì)液2.00mL，25℃水浴反應(yīng)30min后立即加入1.5mL硫酸終止反應(yīng)，加碘化鉀5mL，60℃水浴加熱40min，冷卻，加淀粉3mL，定容，以蒸餾水作參比液，在波長600nm處測吸光度A，同時(shí)完成酶空白試驗(yàn)吸光度A₀測定，根據(jù)△A(△A=A₀一A)確定過氧化氫酶活性E。其他條件不變，考察了淀粉用量影響。結(jié)果表明，在0～2.75mL之間，A隨淀粉體積增大，2.75mL后，A趨于恒定。實(shí)驗(yàn)選擇3mL淀粉作顯色劑。

4、硫酸用量

取50ml容量瓶一只，加入CAT樣液(酶活性小于2U／mL)1.00mE、H202基質(zhì)液2.00mL，25℃水浴反應(yīng)30min后立即加入1.5mL硫酸終止反應(yīng)，加碘化鉀5mL，60℃水浴加熱40min，冷卻，加淀粉3mL，定容，以蒸餾水作參比液，在波長600nm處測吸光度A，同時(shí)完成酶空白試驗(yàn)吸光度A₀測定，根據(jù)△A(△A=A₀一A)確定過氧化氫酶活性E。其他條件不變，考察硫酸體積對顯色反應(yīng)影響，并同步完成pH測定(圖2)。結(jié)果表明，當(dāng)V(H₂SO₄)=1.5mL時(shí)，pH=1.80，顯色最完全，A值達(dá)到最大。0.1mol／LH₂SO₄溶液最佳用量為1.5mL。

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