2.6 指紋圖譜建立及分析

2.6.1 指紋圖譜的建立

取“2.1”項(xiàng)的對(duì)照品溶液和“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)的色譜條件，使用高效液相色譜儀檢測(cè)。所得滿山紅葉HPLC對(duì)照?qǐng)D譜見圖4，15批滿山紅葉色譜疊加圖見圖5。

圖4所示，該指紋圖譜找到10個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品色譜圖對(duì)比，確認(rèn)10號(hào)峰為杜鵑素，并將9號(hào)峰作為參照S峰。

2.6.2 相似度分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”(2012版)，采用中位數(shù)法依次進(jìn)行15批滿山紅葉指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見表9。根據(jù)表9能夠得出，15批滿山紅葉紋圖譜整體相似度在0.986～0.999，均>0.9，具有較高的一致性。

2.6.3聚類分析

將15批滿山紅葉的10個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0，運(yùn)用平均歐式距離法，進(jìn)行聚類分析，見圖6。分類結(jié)果表明不同產(chǎn)地滿山紅藥材在分類距離上較遠(yuǎn)，即使同一產(chǎn)地其分類距離也存在明顯差異性。初步分析，可能與滿山紅藥材采摘時(shí)間、貯存方式、氣候等有關(guān)。15批滿山紅葉在產(chǎn)地和批次上其主化學(xué)成分種類具有代表性，指紋圖譜能夠反映出樣品的全貌。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)供試品的制作方法，考察了不同提取溶劑和提取方式對(duì)滿山紅葉指紋圖譜的影響。在提取溶劑方面，選取了水、60%甲醇、稀乙醇三種溶劑作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滿山紅凍干粉在三種溶劑中的溶解度都很好，但是以水作提取溶劑的色譜圖無論在出峰數(shù)目還是分離度上均優(yōu)于其他兩種溶劑的色譜圖，因此選擇水作為提取溶劑。在提取方式方面，選擇了超聲提取法和回流提取法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法提取的滿山紅葉色譜圖差別很小，但是超聲提取方法更加簡便，因此選擇超聲的方法作為提取方法。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)于色譜條件的確定，考察了色譜柱、檢測(cè)波長、流動(dòng)相系統(tǒng)，流速、柱溫對(duì)滿山紅葉指紋圖譜的影響。在色譜柱方面，選了Shim-Pack XR-ODSⅤ（2.0 mmi.d×150 mm）、Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm）和YMC-Pack ODS-A(4.6 mm×250 mm,5μm）色譜柱，結(jié)果表明樣品在Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm）和YMC-Pack ODS-A(4.6 mm×250 mm,5μm）中不能達(dá)到分離要求，而在Shim-Pack XR-ODSⅤ（2.0 mmi.d×150 mm）色譜柱中不僅出峰快、數(shù)目多而且分離度符合要求，所以選擇Shim-Pack XR-ODSⅤ（2.0 mmi.d×150 mm）色譜柱作為該實(shí)驗(yàn)色譜柱。

在檢測(cè)波長方面，用二極管陣列檢測(cè)器檢（DAD）中200～400 nm依次掃描對(duì)照品溶液和供試品溶液，結(jié)果顯示在檢測(cè)波長297 nm處2個(gè)樣品均有最大吸收，色譜圖信息豐富，杜鵑素峰高較高，所以選用297 nm為檢測(cè)波長。在流動(dòng)相系統(tǒng)方面，選取不同種類有機(jī)相（甲醇、乙腈）和不同成分水相（0.3%甲酸水溶液、0.3%醋酸水溶液）構(gòu)成的流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)供試品溶液色譜峰分離的影響，篩選乙腈-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.3%醋酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，乙腈-0.3%甲酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)不利于樣品的分離，出峰數(shù)目稀少且分離度不好，甲醇-0.3%甲酸水溶液和甲醇-0.3%醋酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)樣品分離差別不明顯，但是甲醇-0.3%甲酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)色譜圖信息更豐富，分離度更好，故確定該流動(dòng)相系統(tǒng)作為該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的流動(dòng)相。在流速方面，選擇了0.1 mL·min-1、0.2 mL·min-1、0.25 mL·min-1進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，用0.1 mL·min-1流速檢測(cè)色譜峰出峰不完全，用0.25 mL·min-1流速檢測(cè)色譜峰分離度不好，用0.2 mL·min-1流速檢測(cè)色譜峰出峰數(shù)目完全，分離度較好，故確定流速為0.2 mL·min-1。在柱溫方面，對(duì)25℃、30℃、35℃柱溫進(jìn)行篩選。結(jié)果表明升高柱溫，分離效果變差，因此確定了25℃作為檢測(cè)柱溫。

15批滿山紅葉的指紋圖譜整體相似度范圍0.986～ 0.999，均>0.9，相似度良好，15批滿山紅葉中杜鵑素含量RSD為0.11%，表明其含量沒有明顯差異，但是聚類分析結(jié)果將15批滿山紅葉分為四類，且10個(gè)共有峰峰面積的RSD范圍6%～30%，說明杜鵑素的含量對(duì)其整體含量變化影響很小，其他化學(xué)成分含量變化起主要作用，初步分析應(yīng)該與滿山紅中草藥產(chǎn)地、生長環(huán)境、采摘時(shí)間、放置條件和放置時(shí)間等有關(guān)。

本研究運(yùn)用高相液相色譜分析法，建立了滿山紅葉的指紋圖譜，該指紋圖譜可以全面展現(xiàn)滿山紅葉化學(xué)成分的特點(diǎn)，適用于因產(chǎn)地、批次、生長環(huán)境等因素的不同，出現(xiàn)的質(zhì)量不均一的滿山紅葉。該方法簡便易行，指紋峰分離度好，具有較高的可信度，為后續(xù)滿山紅葉的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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