雜色曲霉素是由雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉等產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。該毒素是致癌物質(zhì)，主要污染大米、玉米、小麥等谷物和花生、黃豆。雜色曲霉毒的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖21—1。

雜色曲霉素為淡黃色結(jié)晶，分子式為C18 H12O6，分子量為324。在紫外光燈下具有暗磚紅色熒光。雜色曲霉素溶于極性弱的溶劑中，如三氯甲烷或比三氯甲烷極性更弱的溶劑，微溶于很多其他溶劑，不溶于水。由于毒素帶酚羥基，羥基在一定的條件下發(fā)生水解而影響對(duì)光的吸收性能，當(dāng)用分光光度法測(cè)定毒素時(shí)必然影響結(jié)果，故實(shí)驗(yàn)時(shí)必須注意酸和溶劑。目前我國(guó)還沒有制定雜色曲霉素的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，采用的分析方法主要是薄層色譜法和高效液相色譜法。但高效液相色譜法的回收率和檢出限度均不理想，現(xiàn)介紹薄層色譜標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。

一、適用范圍

本方法適用于大米、玉米、小麥、黃豆及花生等各種食品中雜色曲霉素的測(cè)定。

二、原理

樣品中的雜色曲霉素經(jīng)提取、凈化、濃縮、薄層展開后，用三氯化鋁顯色，再經(jīng)加熱產(chǎn)生一種在紫外光下顯示黃色熒光的物質(zhì)，根據(jù)其在薄層上顯示的熒光最低檢出量來(lái)測(cè)定樣品中雜色曲霉素的含量。

三、試劑

1、三氯甲烷；

2、正己烷或石油醚(30～600C或60～900C)；

3、甲醇；

4、苯；

5、冰乙酸；

6、甲酸；

7、95％乙醇；

8、4％氯化鈉溶液；

9、20％三氯化鋁-乙醇溶液：稱取20g三氯化鋁(A1C113·6H2O)，溶于100mL乙醇中，過濾，室溫保存；

10、雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：用雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品配制成每毫升相當(dāng)于lOμg的苯溶液。用紫外分光光度計(jì)標(biāo)定其濃度(最大吸收峰的波長(zhǎng)325nm，分子量324，摩爾消光系數(shù)15200)，并作硅膠薄層色譜純度鑒定，避光，放置于40C冰箱中保存；

11、雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液：用苯將10μg／mL的雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成每毫升相當(dāng)于l和0.4μg的雜色曲霉素溶液。避光，放置于4℃冰箱中保存。

四、儀器

1、小型粉碎機(jī)；

2、樣篩；

3、電動(dòng)振蕩器；

4、全玻璃濃縮器；

5、玻璃板：l0cm×10cm與10cm×18.5cm兩種；

6、展開槽：內(nèi)長(zhǎng)10cm、寬4.5cm、高17cm與內(nèi)長(zhǎng)11.5cm、寬60cm、高19cm；

7、噴霧器；

8、空氣泵或油泵；

9、紫外光燈：波長(zhǎng)365nm；

10、微量注射器。

五、操作步驟

(一)樣品溶液的制備

稱取20g過20目篩的大米、玉米、小麥及黃豆樣品(花生樣品過10目篩孔)，置于具塞錐形瓶中，加80mL甲醇-4 %氯化鈉水溶液(90+lO)，振蕩30min，過濾。收集樣液40mL(黃豆、花生樣品則取20mL，加入20mL提取劑)，移入250mL分液漏斗中，再加入25mL4％氯化鈉溶液(使甲醇與水之體積比為55:45)和25mL石油醚，振搖2min，靜置分層。上層石油醚溶液置錐形瓶中，下層溶液仍移入原分液漏斗中，再用25mL石油醚提取一次。最后將兩次上層的石油醚溶液合并，加入25mL甲醇-4％氯化鈉水溶液(55+45)，振搖30s[黃豆、花生樣品則加入25mL甲醇-4％氯化鈉溶液(70+30)，振搖30s]，將下層并于原甲醇水層中，重復(fù)用甲醇-4％氯化鈉溶液(55+45)提取兩次[黃豆、花生樣品重復(fù)用甲醇-4％氯化鈉溶液(70+30)提取一次]，以提取該層的雜色曲霉素。下層溶液合并后加30mL三氯甲烷(黃豆、花生樣品除加三氯甲烷外，再加13mL4％氯化鈉溶液，使甲醇與水的體積比為55:45)振搖2min，靜置。待上層混濁液有部分澄清時(shí)，即可將下層溶液經(jīng)放有約10g無(wú)水硫酸鈉的定量慢速濾紙過濾于蒸發(fā)皿中。于分液漏斗中再加10mL三氯甲烷，重復(fù)提取一次，將該下層溶液和用少量三氯甲烷洗濾器的洗液一并放入蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿置于65℃水浴上揮干，然后再在冰浴上放置2～3min，加1.OmL苯將殘留物充分混勻，置入小試管中?；?qū)⒁陨险舭l(fā)皿中殘留物用三氯甲烷移于濃縮管中，于65℃用減壓吹氣法濃縮至干，加入1.OmL苯，供色譜測(cè)定，此1mL大米、玉米及小麥樣液各相當(dāng)于10g樣品，1mL黃豆與花生樣液則各相當(dāng)于5g樣品。

(二)薄層色譜測(cè)定

1、薄層板的制備：稱取5g硅膠G，加相當(dāng)于硅膠量2～3倍左右的水，用力研磨1～2 min至成糊狀后，立即倒于涂布器內(nèi)，鋪成10cm×10cm、厚度0.3mm薄層板五塊。

2、點(diǎn)樣：取兩塊10cm×10cm薄層板，在距板下端各0.8～1cm基線上滴加標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液如下：距左邊緣0.8～1cm處各滴加10μL0.4μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液，在距左邊緣4cm處各滴加80μL樣液(黃豆、花生樣品為40μL)，然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上加滴10μL O.4μg／mL標(biāo)準(zhǔn)使用液，在滴加樣液時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)邊吹邊加。

3、展開：

(1)展開劑

橫展劑：乙醚一正己烷一苯一三氯甲烷一甲酸(3+9+1.5+1.5+O.6)15.6 mL(由于此混合液不成一相，每一展開槽的用量須單獨(dú)配制)。用前充分搖勻，一并倒入槽內(nèi)使用。

縱展劑：苯-甲醇-冰乙酸(90+8+2或92.5+6+1.5)15mL。一并倒入槽內(nèi)使用。

(2)橫向展開：將靠近標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的一邊放入盛有橫展劑的槽內(nèi)，展至9cm左右取出揮干。

(3)縱向展開：將靠近標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣品點(diǎn)的一邊放入盛有縱展劑的槽內(nèi)，展開9cm左右取出揮干。

4、顯熒光：在薄層板上噴20%三氯化鋁-乙醇溶液，置80℃，加熱10min，立即在紫外光燈下觀察結(jié)果，待薄層板冷卻后再薄薄地噴第二次(不需

5、觀察與評(píng)定：在紫外光燈下觀察，若第二塊板的第二點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而在第一板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則樣品中雜色曲霉素含量在5μg／kg以下(黃豆、花生樣品為20μg／kg)；若出現(xiàn)熒光點(diǎn)的強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低檢出量的熒光強(qiáng)度相等，而且此熒光點(diǎn)又同第二板樣液的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，則樣品中雜色曲霉素含量為5μg／kg(黃豆、花生樣品為20μg／kg)；若出現(xiàn)熒光強(qiáng)度比標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其熒光強(qiáng)度估計(jì)減少滴加微升數(shù)，或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。在噴三氯化鋁第一、二次后分別進(jìn)行觀察評(píng)定，兩次結(jié)果應(yīng)一致。若結(jié)果為陽(yáng)性，則將薄層板放暗處10 min，再觀察一次，如樣品仍為陽(yáng)性，進(jìn)一步做確證試驗(yàn)，即在距薄層板(10cm×18.5cm)F端3cm的基線上滴加一個(gè)點(diǎn)的10μL O.4μg／mL標(biāo)準(zhǔn)使用液與3個(gè)點(diǎn)的樣液，每點(diǎn)16μL。在樣液的一個(gè)點(diǎn)上再加滴10μLO.4μg／mL標(biāo)準(zhǔn)使用液，另一點(diǎn)上再加滴10μL lμg／mL標(biāo)準(zhǔn)使用液。于各點(diǎn)上再加一小滴三氟乙酸，放暗處反應(yīng)10min，熱風(fēng)吹5min，使薄層板上的溫度不高于400C，用冰乙酸一苯(10+90)展開1～2次，直至雜色曲霉素衍生物與雜質(zhì)分開為止。展開時(shí)要避光，以下顯熒光步驟同“(4)顯熒光”項(xiàng)下。最后將板在紫外光燈下觀察，如樣液為陽(yáng)性，應(yīng)產(chǎn)生與雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)重疊的衍生物。確證法的靈敏度：大米、玉米、小麥為25μg／kg(黃豆、花生樣品為50μg／kg)。

6、計(jì)算：

式中：X——雜色曲霉素含量，μg/kg；

 V1——樣液濃縮后體積，mL；

V2——出現(xiàn)最低熒光樣液的滴加體積，mL；

D——濃縮樣液的總稀釋倍數(shù)；

m——濃縮樣液中所相當(dāng)?shù)臉悠焚|(zhì)量，g；

0.004——雜色曲霉素的最低檢出量，μg。

六、注意事項(xiàng)

(一)在大米、玉米或小麥樣品中加入雜色曲霉素5μg/kg時(shí)(黃豆、花生樣品中加入水平為20μg／kg)，用雙向薄層色譜法測(cè)定，雜色曲霉素的回收率均達(dá)75％mL，故認(rèn)為用本方法測(cè)定大米、玉米及小麥的方法靈敏度為5μg/kg，黃豆、花生則為20μg/kg。做樣品中雜色曲霉素回收率時(shí)，須先將所需的雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)液加入準(zhǔn)備稱樣的具塞錐形瓶中，以吹風(fēng)機(jī)用冷風(fēng)將標(biāo)準(zhǔn)液的溶劑吹干后，再將樣品加入，以下操作方法與樣品測(cè)定相同。

(二)在薄層色譜上噴以三氯化鋁乙醇溶液，使雜色曲霉素分子結(jié)構(gòu)上的酮基與羥基和鋁離子結(jié)合成絡(luò)合物后，產(chǎn)生黃色熒光，其熒光強(qiáng)度較雜色曲霉素本身具有的暗磚紅色熒光約提高100倍。

(三)由于雜色曲霉素微溶于石油醚，所以還需用甲醇-4％氯化鈉溶液提回石油醚層中微量的雜色曲霉素。

(四)展開劑用量隨展開槽大小而定，用量要合適，過多的展開劑會(huì)將板上的點(diǎn)浸泡在展開劑中。

(五)薄薄地噴第二次三氯化鋁一乙醇溶液，其作用能消除板上微弱的底色。

(六)由于在薄層色譜上用目視能區(qū)分與雜色曲霉素最低檢出量相差±20%劑量的熒光強(qiáng)度，因此用目視定量的誤差范圍為±20%左右。

(七)在200多份的樣品測(cè)定中，有一份在薄層色譜測(cè)定中樣液在標(biāo)準(zhǔn)相應(yīng)處出現(xiàn)類似雜色曲霉素的熒光點(diǎn)，但此點(diǎn)在暗處過10min后即消失，因此如為陽(yáng)性樣品，須將板在暗處放10min后再觀察一次，以避免樣品的假陽(yáng)性。

參考資料：食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)