鰱魚(yú)（Silvercarp，Hypophthalmichthysmolitrix），脊索動(dòng)物門(mén)、硬骨魚(yú)綱、鯉形目、鯉科、鰱屬，是著名的四大家魚(yú)之一，產(chǎn)量?jī)H次于草魚(yú)，2019年年產(chǎn)值381.03萬(wàn)t。鰱魚(yú)中含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和多種不飽和脂肪酸，包括8種必需氨基酸和組氨酸，其中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的含量達(dá)到海水魚(yú)標(biāo)準(zhǔn)；鰱魚(yú)中還含有鉀、鈉、鈣、鎂、磷等常量元素以及鋅、硒、鐵等微量元素。其肉薄刺多，土腥味較重，市場(chǎng)上主要以活體的銷(xiāo)售為主，部分鰱魚(yú)被加工成凍品魚(yú)片、魚(yú)粉制品及魚(yú)丸，使用率不高，還造成很多的垃圾，破壞環(huán)境，資源浪費(fèi)嚴(yán)重，消費(fèi)者接受程度低于其它水產(chǎn)品。通過(guò)加工成魚(yú)糜制品，可提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

魚(yú)糜制品在凍藏過(guò)程中易腐敗變質(zhì)。其腐敗機(jī)制涉及生物、化學(xué)、物理等變化，其中，微生物是引起腐敗的主要因素，特別是新鮮和冷凍食品，由于未經(jīng)過(guò)高溫處理或其它處理方式消毒，附著在食品中的微生物生長(zhǎng)繁殖，最終導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)。Lücking等對(duì)369種腐敗的食品樣品的研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌占主導(dǎo)地位，還檢測(cè)到少數(shù)的海水芽胞八疊球菌，同時(shí)證明地衣芽胞桿菌具有一定的蛋白水解酶活性，能夠分解利用蛋白質(zhì)。本團(tuán)隊(duì)以往的研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌是造成鰱魚(yú)糜制品腐敗的優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一。1945年，瑞士Rose等在地衣芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶，它是一類(lèi)在堿性條件下能夠水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類(lèi)。趙巧靈利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究金槍魚(yú)在冷藏過(guò)程中的品質(zhì)變化，魚(yú)肉組織蛋白酶加速肌原纖維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)降解過(guò)程，破壞魚(yú)肉組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致魚(yú)肉品質(zhì)下降。

本試驗(yàn)中，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶對(duì)鰱魚(yú)肌原纖維蛋白的降解作用，尋找降解過(guò)程中的肌原纖維蛋白差異蛋白點(diǎn)，并利用GO功能注釋及KEEG通路分析鰱魚(yú)肌原纖維蛋白微生物降解的途徑，為今后鰱魚(yú)等水產(chǎn)品的微生物腐敗研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

活鰱魚(yú)購(gòu)于遼寧省錦州市林西路水產(chǎn)市場(chǎng)，1h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，立即冰水致死。固相pH值梯度（immobilizedpHgradient，IPG）預(yù)制干膠條（pH4～7，17cm）、載體兩性電解質(zhì)（pH3～10、pH5～8、pH4～6和pH5～7）、Ｔrisbase、苯甲基磺酰氟（PMSF）、尿素、硫脲、二硫蘇糖醇（DＴＴ）、碘乙酰胺、3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）所需丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、礦物油、四甲基乙二胺（ＴEMED）、過(guò)硫酸銨、甘氨酸均購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)BioRad公司；甘油、溴酚藍(lán)、瓊脂糖均為國(guó)產(chǎn)分析純，所有溶液均以Milli-Q超純水系統(tǒng)制備的超純水為溶劑。

1.2儀器與設(shè)備

5800MALDI-ＴO(shè)F/ＴO(shè)F質(zhì)譜儀，ABSCIEX公司；UＶ-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；MILLI-QREFERENC超純水系統(tǒng)，美國(guó)密理博公司；GS-800-ＴM校正型光密度掃描儀，美國(guó)Bio-Rad公司；DL-1005型低溫冷卻液循環(huán)系統(tǒng)，上海漢諾儀器有限公司；PROＴEANIEF等電聚焦電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；PROＴEAN83ⅡXL電泳槽，美國(guó)Bio-Rad公司；ZD-9556型水平脫色搖床，常州市凱航儀器有限公司；FE20pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；SORＶALLStratos冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Ｔhermo公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1原料預(yù)處理

1.3.1.1鰱魚(yú)肌原纖維蛋白提取

參考李學(xué)鵬等的方法，取魚(yú)肉20g并絞碎。加入5倍體積10mmol/L的Ｔris-HCl（pH7.2），高速均質(zhì)2min，每隔30s，停30s。在5000r/min、4℃條件下離心15min。取沉淀，在沉淀中加入3倍體積的ＴrisHCl（含0.6mol/LNaCl，10mmol/LＴris，pH7.2）緩沖液，高速均質(zhì)，后在4500r/min、4℃條件下離心15min，雙縮脲法測(cè)定其濃度。取上清液貯藏在-80℃冰箱中備用。

1.3.1.2堿性蛋白酶處理

將干酶粉稀釋至0.01g/mL，并取20mL肌原纖維蛋白溶液，添加相當(dāng)于蛋白質(zhì)質(zhì)量0.1%的堿性蛋白酶酶液，置于磁力攪拌器上，分別在4℃和25℃下反應(yīng)。堿性蛋白酶處理時(shí)間分別為：4℃選取0，1，2h；25℃選取0，0.5，1h。反應(yīng)結(jié)束后立即加入適量50mmol/LPMSF抑制酶活。

1.3.2雙向電泳

1.3.2.1等電聚焦程序

參考Bio-Rad公司雙向電泳操作技術(shù)手冊(cè)及本團(tuán)隊(duì)前期已探索出鰱魚(yú)肌原纖維蛋白的雙向凝膠電泳技術(shù)（twodimensionalgelelectrophoresis，2-DE）進(jìn)行試驗(yàn)。將適量的已定量蛋白質(zhì)溶液與水化上樣緩沖液（含7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、65mmol/LDＴＴ、0.2%載體兩性電解質(zhì)和0.001%溴酚藍(lán)）充分混合，采用17cm，pH4～7的IPG預(yù)制干膠條進(jìn)行等電聚焦，100μg，300μL主動(dòng)水化上樣，顯色方式為硝酸銀染色。等電聚焦程序參數(shù)設(shè)置如表1所示。

1.3.2.2膠條平衡

等電聚焦結(jié)束后，每根膠條用6mL膠條平衡緩沖液Ⅰ〔6mol/L尿素、2%SDS、0.375mol/LＴris-HCl（pH8.8）、20%甘油和2%DＴＴ〕和緩中液Ⅱ[6mol/L尿素、2%SDS、0.375mol/LＴris-HCl（pH8.8）、20%甘油和2.5%碘乙酰胺]進(jìn)行膠條平衡，每次14min。

1.3.2.3第二向SDS-PAGE垂直凝膠電泳

將平衡完畢的膠條于1×電極緩沖液（含3g/LＴrisbase、14.4g/L甘氨酸、1g/LSDS）中洗去多余平衡液，分別轉(zhuǎn)移至提前制好的第二向10%，12%，15%聚丙烯酰胺分離膠上端，并加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（0.5%低熔點(diǎn)瓊脂、25mmol/LＴris-base、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS和0.001%溴酚藍(lán)），排除氣泡，待其徹底凝固后，轉(zhuǎn)移至垂直電泳槽中，恒壓進(jìn)行第二向SDS-PAGE，程序見(jiàn)表2。

1.3.2.4銀染、凝膠成像及分析

采用參考文獻(xiàn)的方法并略有修改。將銀染后的凝膠轉(zhuǎn)至GS-800凝膠掃描成像儀投射平臺(tái)上。

采用PDQuest8.0二維凝膠圖像專(zhuān)業(yè)分析軟件對(duì)所得圖像進(jìn)行背景消減、蛋白點(diǎn)檢測(cè)和匹配等處理，尋找差異蛋白點(diǎn)。

1.3.3差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

1.3.3.1酶解

參考Addis等和Bernevic等的方法，從銀染的凝膠上得到蛋白質(zhì)點(diǎn)，放入硅化處理過(guò)的1.5mL微量離心管中，用超純水反復(fù)漂洗后，對(duì)該蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切。

1）脫色

在放有蛋白點(diǎn)的離心管中，加入50μL脫色液[15mmol/LK3Fe（CN）6溶于50mmol/LNa2S2O3中]，將蛋白點(diǎn)的棕色脫色至淡綠色，用超純水漂洗以終止反應(yīng)，直至蛋白點(diǎn)變?yōu)闊o(wú)色透明。然后將蛋白點(diǎn)所附著的丙烯酰胺切碎，用100mmol/LNH4HCO3漂洗，并用100%乙腈（色譜純）脫色至丙烯酰胺凝膠顏色變白，隨后將其置于冷凍真空干燥器中進(jìn)行凍干。

2）酶解

用pH8.0的胰蛋白酶液（以50mmol/L碳酸氫銨溶液為溶劑）將凍干的樣品于37℃酶解過(guò)夜。每個(gè)蛋白點(diǎn)胰蛋白酶用量根據(jù)蛋白點(diǎn)大小，每個(gè)蛋白點(diǎn)約40～100ng胰蛋白酶。

3）萃取

酶解后的肽段用60μL5%ＴFA和50%乙腈進(jìn)行萃取，重復(fù)2次，每次15min，合并萃取液并真空抽干。

4）樣品復(fù)溶與脫鹽

采用0.1%ＴFA溶液將干燥后的樣品再次復(fù)溶，并用ZipＴIP移液嘴脫鹽。將1μL除鹽后的樣品置于質(zhì)譜樣品板上進(jìn)行自然干燥，進(jìn)行MALDI-ＴO(shè)F/ＴO(shè)F分析，檢測(cè)條件見(jiàn)表3。

聲明：本文所用圖片、文字來(lái)源《中國(guó)食品學(xué)報(bào)》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)

相關(guān)鏈接：二硫蘇糖醇，蛋白酶，四甲基乙二胺，丙烯酰胺