3.2 中藥中BChE抑制劑的快速篩選

運(yùn)用UPLC-DAD-BCD方法對(duì)吳茱萸、鉤藤、苦參和山豆根提取物中的BChE抑制劑進(jìn)行篩選結(jié)果見(jiàn)圖3。吳茱萸中有4個(gè)峰在405 nm檢測(cè)中顯示倒峰，表明具有BChE抑制活性。鉤藤中有3個(gè)倒峰、苦參中有5個(gè)倒峰、山豆根中有2個(gè)倒峰。其中吳茱萸中的4號(hào)峰顯示較強(qiáng)的BChE抑制活性。在線分析方法由于是流動(dòng)性的反應(yīng)檢測(cè)，更能快速發(fā)現(xiàn)活性較強(qiáng)、酶抑制速度快的成分。

3.3 活性成分鑒定

為了明確吳茱萸、鉤藤、苦參和山豆根提取物中的活性成分，采用UHPLC-LTQ/Orbitrap MS方法分別對(duì)4種中藥中出現(xiàn)倒峰的成分進(jìn)行鑒定。根據(jù)各峰保留時(shí)間、質(zhì)譜信息等與參考文獻(xiàn)相比較，結(jié)果顯示峰1，2，3，4，6，7，8，9分別為去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、1-甲基-2--4(1H)-喹諾酮、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、苦參堿和氧化苦參堿，其中峰5，10，11和12有待進(jìn)一步研究加以鑒別?；钚猿煞骤b定結(jié)果見(jiàn)表1。

化合物1：來(lái)源于吳茱萸，保留時(shí)間42.56 min，正離子模式，其準(zhǔn)分子離子為m/z302.1281+，二級(jí)質(zhì)譜顯示其主要碎片m/z 287.105 4 +和286.0984+，結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物1為去氫吳茱萸堿。

化合物2：來(lái)源于吳茱萸，保留時(shí)間72.87 min，正離子模式，其準(zhǔn)分子離子為m/z304.144 3+，二級(jí)質(zhì)譜顯示其碎片m/z286.096 9+，m/z171.091 8為準(zhǔn)分子離子斷裂Ｂ環(huán)+，m/z161.071 1準(zhǔn)分子離子斷裂C環(huán)+，m/z144.080 8和134.060 0分別為+和+，結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物2為吳茱萸堿。

化合物3：來(lái)源于吳茱萸，保留時(shí)間75.13 min，正離子模式，其準(zhǔn)分子離子為m/z288.112 9+，二級(jí)質(zhì)譜顯示其主要碎片m/z273.102 2+，m/z244.086 9為準(zhǔn)分子離子脫去C2H4O，m/z145.039 6為C環(huán)斷裂脫去C10H8N·，結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物3為吳茱萸次堿。

化合物4：來(lái)源于吳茱萸，保留時(shí)間81.60 min，正離子模式，其準(zhǔn)分子離子為m/z366.2783+，二級(jí)質(zhì)譜顯示其主要碎片m/z352.891 6 +，322.490 2為+，186.091 9為+，結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物4為1-甲基-2--4(1H)-喹諾酮。

化合物6：來(lái)源于鉤藤，保留時(shí)間68.88 min，正離子模式，其準(zhǔn)分子離子為m/z367.201 4+，二級(jí)質(zhì)譜顯示其主要碎片m/z335.175 9，298.143 6，224.128 0和144.080 7，分別為準(zhǔn)分子離子丟失CH3OH、C4H7N、C10H9N和C12H17NO3的碎片，結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物6為去氫毛鉤藤堿。

化合物7：來(lái)源于鉤藤，保留時(shí)間72.93 min，正離子模式，其準(zhǔn)分子離子為m/z369.2165+，二級(jí)質(zhì)譜顯示其主要碎片m/z337.190 6，298.143 9，226.143 6和144.080 7，分別為準(zhǔn)分子離子丟失CH3OH、C4H9N、C10H9N和C12H19NO3的碎片，結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物7為毛鉤藤堿。

化合物8：來(lái)源于苦參和山豆根，保留時(shí)間8.04 min，正離子模式，其準(zhǔn)分子離子為m/z249.195 7+，二級(jí)質(zhì)譜顯示其主要碎片m/z231.185 5+，結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物8為苦參堿。

化合物9：來(lái)源于苦參和山豆根，保留時(shí)間14.12 min，正離子模式，其準(zhǔn)分子離子為m/z265.190 5+，二級(jí)質(zhì)譜顯示其主要碎片m/z247.190 8+，m/z205.138 3+，m/z 148.112 5+結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物9為氧化苦參堿。

3.4 討論

本研究建立了一種UPLC-DAD-BCD在線分析方法，用于快速篩選吳茱萸、鉤藤、苦參和山豆根4種藥材中的BChE抑制劑，發(fā)現(xiàn)12個(gè)成分具有BChE抑制活性，通過(guò)UHPLC-LTQ/Orbitrap方法鑒定出8種活性成分，如：去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、1-甲基-2--4(1H)-喹諾酮、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、苦參堿和氧化苦參堿。研究表明，建立的儀器聯(lián)用系統(tǒng)穩(wěn)定、在線分析方法靈敏，能夠廣泛用于中藥復(fù)雜基質(zhì)中生物效應(yīng)成分的快速篩查。

中藥成分復(fù)雜多樣，傳統(tǒng)植物化學(xué)分離純化活性成分的方法，存在資源消耗，大量的人力物力投入到分離已知的和沒(méi)有意義的化合物研究，本研究方法采用高效色譜分離、流動(dòng)注射在線反應(yīng)、生物化學(xué)實(shí)時(shí)檢測(cè)于一體的在線分析技術(shù)，快速評(píng)價(jià)單一成分生物效應(yīng)，只需少量的樣品即可滿足活性成分的篩選和鑒定，為中藥復(fù)雜基質(zhì)中新的生物活性物質(zhì)的快速發(fā)現(xiàn)，提供了一種高效、便捷的分析策略。

本研究建立的在線UPLC-DAD-BCD方法能夠用于快速篩查其他酶或受體生物效應(yīng)成分，通過(guò)對(duì)中藥復(fù)雜成分的不同靶點(diǎn)活性分析，為闡釋中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)的多靶點(diǎn)協(xié)同作用機(jī)制及配伍規(guī)律組方原理提供一種有效的研究方法和技術(shù)手段。

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