乳酸菌是指發(fā)酵乳糖主要產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱。其廣泛分布于自然界中，一般主要存在于人體、動(dòng)物體及各種發(fā)酵食品中。1905年，Grigoroff首次從酸奶中分離出保加利亞乳桿菌（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）。該菌株是酸奶發(fā)酵劑中重要的菌種之一，具有清腸、整腸、提高機(jī)體免疫力、抗癌及抗腫瘤等重要的生物學(xué)功能。

Kataoka等研發(fā)出一種樣品前處理技術(shù)-固相微萃取（Solid-phasemicroextraction，SPME）。SPME技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在風(fēng)味檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域。武士美等采用SPME-GC/MS技術(shù)對(duì)保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，鑒定了乙酸、乙醛、雙乙酰、乙偶姻、乙酸乙烯酯等多種風(fēng)味化合物，并篩選出具有優(yōu)良風(fēng)味的菌株。Bao等采用該技術(shù)分析干酪乳桿菌（Lactobacillscasei）發(fā)酵乳中的揮發(fā)性化合物，檢測(cè)出的主要風(fēng)味化合物有乙酸、丁酸、雙乙酰和己酸乙酯等。任為一等采用該技術(shù)分析發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)雙乙酰、乙偶姻、乙醛、2-壬酮等化合物對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

酸奶是一種受消費(fèi)者喜愛(ài)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，然而，關(guān)于保加利亞乳桿菌在牛乳發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的風(fēng)味及其發(fā)酵特性的報(bào)道較少。本研究以來(lái)自蒙古國(guó)和西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的7株保加利亞乳桿菌為研究對(duì)象，系統(tǒng)考察貯藏12h時(shí)發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)的多樣性，并測(cè)定發(fā)酵和貯藏12h時(shí)的pH值、滴定酸度（ＴA）、活菌數(shù)和黏度，旨在為傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑的基礎(chǔ)研究提供參考。

1材料與方法

1.1菌株與試劑

內(nèi)標(biāo)（InternalStandard，ISＴD）1，2-二氯苯，Sigma公司；全脂奶粉，美國(guó)Fonterra公司；MRS液體培養(yǎng)基（MRSBROＴH），英國(guó)Oxoid公司。試驗(yàn)菌株：7株保加利亞乳桿菌由實(shí)驗(yàn)室提供。菌株詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品制備

將真空冷凍干燥保藏的保加利亞乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，連續(xù)傳3代，使菌株活力達(dá)最大。在50mL和200mLMRS液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集菌體，將菌體重懸于無(wú)菌PBS保護(hù)劑中制備菌懸液。取適量蒸餾水加熱至50℃，加入11.5%全脂乳粉攪拌溶解，當(dāng)水溫升至60℃時(shí)加入6.5%蔗糖，水合30min，且溫度始終保持在60℃，連續(xù)均質(zhì)2次（65℃，15MPa和35MPa），得到的均質(zhì)乳在95℃處理5min后快速冷卻至42℃。將制備好的菌懸液以5×10⁷CFU/mL的量接種到均質(zhì)化的全脂乳中，分裝至樣品瓶，并在42℃發(fā)酵。待樣品的pH值達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)4.5，ＴA在70～90°Ｔ時(shí)，將樣品移至4℃貯藏12h，待測(cè)。

1.2.2發(fā)酵乳的理化特性

1.2.2.1pH值和滴定酸度的測(cè)定

發(fā)酵乳樣品用雷磁PHS-3C型pH計(jì)測(cè)量，調(diào)整溫度在20～22℃范圍，平行測(cè)量發(fā)酵乳的pH值。使用電子天平精確稱量5g發(fā)酵乳樣品，置于100mL錐形瓶中，向錐形瓶中加入40mL蒸餾水和3滴酚酞指示劑，充分搖動(dòng)。加入0.1mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至出現(xiàn)微紅色且30s內(nèi)不退色。記錄加入的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。每個(gè)發(fā)酵乳樣品測(cè)定3個(gè)平行。計(jì)算滴定酸度（ＴA）的公式（1）如下：

式中：X—發(fā)酵乳樣品的酸度，°Ｔ；c—NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；v—滴定時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；m—發(fā)酵乳樣品的質(zhì)量，g；0.1—酸度理論定義NaOH溶液的濃度，mol/L。

1.2.2.2黏度的測(cè)定

取40g發(fā)酵乳樣品，用黏度儀的4#轉(zhuǎn)子測(cè)定其黏度，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速100r/min，扭矩20%～100%，測(cè)定時(shí)間30s，每個(gè)樣品測(cè)定3個(gè)平行，取平均值。

1.2.2.3乳酸菌活菌

計(jì)數(shù)采用稀釋平皿傾注法檢測(cè)保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中活菌數(shù)的變化。用0.85%無(wú)菌NaCl對(duì)樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取10^-5，10^-6，10^-7的稀釋液各1mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿上，37℃厭氧培養(yǎng)48h。

1.2.3揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

使用Agilent7890B氣相色譜儀和5977A質(zhì)譜儀測(cè)定發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物。將萃取頭（50/30μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）在Agilent7890B氣相色譜儀進(jìn)樣口（250℃）老化5min，插入氣相瓶上方，萃取樣品中的風(fēng)味化合物。萃取條件：溫度50℃，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速300r/min，萃取時(shí)間60min。柱溫：采用程序升溫，初始溫度35℃，保持5min；以5℃/min升至140℃，保持2min后以10℃/min速率升至250℃。試驗(yàn)用載氣為高純氦氣，載氣流速1.0mL/min，不分流進(jìn)樣。汽化室溫度250℃。電離方式EI離子源，電子能量70eＶ，離子源溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍m/z35～500，發(fā)射電流100μA，檢測(cè)電壓1.4kＶ，無(wú)溶劑延遲。

1.2.4定性與定量分析

利用隨機(jī)攜帶Masshunter工作站NISＴ11標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜結(jié)果，根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算揮發(fā)性風(fēng)味化合物的保留指數(shù)（retentionindex，RI）。參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的RI值鑒定發(fā)酵乳樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。保留指數(shù)（RI）值代入公式（2）計(jì)算：

式中：RＴ——保留時(shí)間（min）；RＴ_（Z）、RＴ_（Z+1）和RＴ_（X）分別為正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)為Z、Z+1和待測(cè)物X的保留時(shí)間，且正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)的保留時(shí)間遵循RＴ_（Z）（X）（Z+1）的順序原則。

將1，2-二氯苯溶液作為ISＴD加入發(fā)酵樣品中，采用峰面積歸一化法計(jì)算所有組分的相對(duì)峰面積比。樣品中各組分風(fēng)味物質(zhì)的濃度代入公式（3）計(jì)算：

式中c_i—試驗(yàn)樣品中各揮發(fā)性風(fēng)味化合物的質(zhì)量濃度，μg/L；cs—1，2-二氯苯的質(zhì)量濃度，μg/L；A_i—樣品中待測(cè)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的色譜峰面積；As—ISＴD的色譜峰面積。
 

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相關(guān)鏈接：1，2-二氯苯，聚二甲基硅氧烷，乳酸菌，乙酸乙烯酯