北方偉業(yè)計(jì)量集團(tuán)有限公司
為了分離到足夠量、有活力的茉莉花原生質(zhì)體,本試驗(yàn)采用酶解法,針對不同組織器官、不同處理方式、酶解液組合、酶解時間等因素進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。
借鑒擬南芥和番茄葉片原生質(zhì)體制備方法,初步嘗試從茉莉花葉片分離原生質(zhì)體,然而得到的原生質(zhì)體多為細(xì)胞碎片,且形狀異常,FDA染色大部分無熒光,顯示存活率極低(圖1-A,B)。然而,以茉莉花花瓣為試材時,在相同的酶解液中可收集到形態(tài)良好,FDA處理發(fā)熒光,有活力的原生質(zhì)體(圖1-C,D),因此在接下來的研究中須專注于優(yōu)化茉莉花花瓣的原生質(zhì)體分離體系。
嘗試了用切絲法、膠撕法和磨砂法在酶解前分別對花瓣組織進(jìn)行處理(圖2-A,B,C),以使花瓣細(xì)胞能充分接觸酶解液。在4m1相同酶解液中孵育6h后,收集觀察原生質(zhì)體產(chǎn)量,在3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)中均顯示切絲法獲得的原生質(zhì)體數(shù)量最多,膠撕法次之,磨砂法得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量最低(圖3)?？紤]到操作的簡易性,切絲法處理茉莉花花瓣對原生質(zhì)體分離最有效。
在含4G·1-1離析酶和2G·1-1果膠酶的酶解液中梯度增加纖維素酶的質(zhì)量濃度從5至30G·1-1,檢測結(jié)果顯示(圖4-A),在一定濃度范圍內(nèi),原生質(zhì)體產(chǎn)量隨纖維素酶質(zhì)量濃度提高而增加,當(dāng)濃度為15G·1-1時,原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到峰值,為1.34×106個·G-1,死亡率為29.1％；隨著纖維素酶質(zhì)量濃度繼續(xù)升高,原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力都開始下降,細(xì)胞破碎程度嚴(yán)重。因此,分離茉莉花花瓣原生質(zhì)體較適宜的纖維素酶質(zhì)量濃度為15G·1-1。在含4G·1-1離析酶和15G·1-1纖維素酶的酶解液梯度增加果膠酶的質(zhì)量濃度從2至10G·1-1,花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)量檢測結(jié)果顯示(圖4-B),隨果膠酶濃度升高,原生質(zhì)體產(chǎn)量同步增加,當(dāng)果膠酶質(zhì)量濃度為8G·1-1時,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高,為1.48×106個·G-1,死亡率較低,為31.0％,較適宜花瓣原生質(zhì)體的分離.試驗(yàn)表明,酶解液中最佳的纖維素酶和果膠酶質(zhì)量濃度分別為15和8G·1-1。
為進(jìn)一步優(yōu)化茉莉花花瓣原生質(zhì)體的分離效率,選取4個酶解時間段3、4、5、6h,采用上述優(yōu)化后的酶解液組合,檢測釋放出來的原生質(zhì)體總量及死亡率。如圖4-C所示,隨著酶解時間延長,原生質(zhì)體產(chǎn)量逐步增多,在酶解5h時,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高,達(dá)到2.96×106個·G-1,死亡率為23.5％,相對較低.因此最適合酶解時間為5h。
本研究進(jìn)一步采用PEG介導(dǎo)法,探討了原生質(zhì)體終濃度、外源dnA含量、不同PEG處理等對茉莉花花瓣原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響。
將收集的花瓣原生質(zhì)體稀釋成不同終濃度的細(xì)胞液,經(jīng)相同的轉(zhuǎn)化方法和孵育時間,熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率,結(jié)果如圖5-A所示,相同轉(zhuǎn)化體系中,外源dnA含量為100μG·m1-1原生質(zhì)體時,最適合轉(zhuǎn)化的茉莉花花瓣原生質(zhì)體濃度為4×105個·m1-1,轉(zhuǎn)化效率約78％。
向原生質(zhì)體濃度為4×105個·m1-1的轉(zhuǎn)化體系中加入不同量的P35s-GFP質(zhì)粒,經(jīng)相同的PEG處理和孵育時間,結(jié)果如圖5-B所示,當(dāng)轉(zhuǎn)化體系中dnA含量為75μG·m1-1原生質(zhì)體時,轉(zhuǎn)化效率最佳,約為79％。
本研究分析了不同終濃度的PEG4000對茉莉花花瓣原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響(圖5-C)。在終濃度為200G·1-1的PEG處理下花瓣原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率顯著高于其他濃度,其次是150和250G·1-1的PEG終濃度,50G·1-1PEG處理下原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率最低。
為進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系,本試驗(yàn)還比較了PEG誘導(dǎo)時間對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響(圖5-D)。PEG處理時間在10min以內(nèi),原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率均達(dá)到70％以上,當(dāng)處理時間超過15min,轉(zhuǎn)化效率顯著降低。
聲明：本文所用圖片、文字來源《福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系
夏季茉莉花的第一次為害高峰（7月下旬至8月下旬）時，性迷向和性誘殺處理對防花被害的平均效果分別為63.08%和77.45%，防有蟲花的控制效果分別為66.65%和80.98%，2處理與農(nóng)戶自防處理無顯著性差異（P＜0.05）。采用性迷向和性誘殺處理技術(shù)后，茉莉花的質(zhì)量增加了4.01%～4.14%，第二次為害高峰（9月初）時，防效最高的性誘殺處理對防花被害和防有蟲花的防效分別為38.88%和42.60%，對秋季蛀花、蛀枝的防效分別為39.99%和40.84%，防效有所下降。
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廣西橫縣不同種植區(qū)域茉莉花的香氣組分及其含量存在較大差異，但采樣點(diǎn)位置與茉莉花香氣組分相關(guān)性不明顯。茉莉花香氣組分主要分為醇類、酯類、醛類、酮類、酸類和烷烴類化合物等；在茉莉花香氣組分的生成和積累過程中，土壤交換性鈣和交換性鎂含量的增加會抑制茉莉花中(E)-2-己烯醛、己醛、八甲基環(huán)四硅氧烷和2-辛酮積累，促進(jìn)己酸含量提高，因此，調(diào)節(jié)土壤交換性鈣和交換性鎂含量可作為后續(xù)茉莉花種植技術(shù)優(yōu)化的重要方法。
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廣西橫縣不同種植區(qū)域茉莉花的香氣組分及其含量存在較大差異，但采樣點(diǎn)位置與茉莉花香氣組分相關(guān)性不明顯。茉莉花香氣組分主要分為醇類、酯類、醛類、酮類、酸類和烷烴類化合物等；在茉莉花香氣組分的生成和積累過程中，土壤交換性鈣和交換性鎂含量的增加會抑制茉莉花中(E)-2-己烯醛、己醛、八甲基環(huán)四硅氧烷和2-辛酮積累，促進(jìn)己酸含量提高，因此，調(diào)節(jié)土壤交換性鈣和交換性鎂含量可作為后續(xù)茉莉花種植技術(shù)優(yōu)化的重要方法。
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廣西橫縣不同種植區(qū)域茉莉花的香氣組分及其含量存在較大差異，但采樣點(diǎn)位置與茉莉花香氣組分相關(guān)性不明顯。茉莉花香氣組分主要分為醇類、酯類、醛類、酮類、酸類和烷烴類化合物等；在茉莉花香氣組分的生成和積累過程中，土壤交換性鈣和交換性鎂含量的增加會抑制茉莉花中(E)-2-己烯醛、己醛、八甲基環(huán)四硅氧烷和2-辛酮積累，促進(jìn)己酸含量提高，因此，調(diào)節(jié)土壤交換性鈣和交換性鎂含量可作為后續(xù)茉莉花種植技術(shù)優(yōu)化的重要方法。
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采用減壓水蒸氣蒸餾法同時提取茉莉花精油和純露。通過優(yōu)化試驗(yàn)，得到最佳提取工藝，即蒸汽量為200L/h、真空度為13.33kPa、提取時間2.5h，在此條件下，茉莉花精油的得率為0.170%，當(dāng)投料量為1000kg時，同時可得茉莉花純露500kg。
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