(5)雜交瘤細胞培養(yǎng)與抗體的分離取篩選出的陽性雜交瘤細胞在CO₂培養(yǎng)箱中進行體外培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。或選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用4-甲基十五烷或液體石蠟進行腹腔注射，1周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中。接種1周后收集小鼠的腹水，分離腹水中的單克隆抗體。

3、抗體純化單克隆抗體的純化方法與多克隆抗體的純化方法類似。目前最有效的單克隆抗體的純化方法是免疫親和色譜法，該法將葡萄球菌A蛋白或抗小鼠免疫球蛋白與適當(dāng)載體(最常用的是Sepharose)交聯(lián)，制備免疫親和色譜柱，將抗體結(jié)合后洗脫，回收率可達90％以上。

(四)標(biāo)記物的制備與純化

半抗原、抗原和抗體的標(biāo)記根據(jù)所選的標(biāo)記免疫分析方法不同，選用不同的標(biāo)記物。如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)常用的標(biāo)記物有辣根過氧化物酶(horseradish Deroxidase，HRP)、堿性磷酸酯酶(alkaline phosptlatase，AP)等，流動注射免疫分析(FIIA)常用的標(biāo)記有魯米諾等，(ABS)系統(tǒng)所用的標(biāo)記物為生物素，金標(biāo)免疫分析所用的標(biāo)記物是納米金。

1、半抗原的標(biāo)記與純化

半抗原的標(biāo)記依標(biāo)記物的種類和半抗原的活性基團不同采用不同標(biāo)記方法。如用辣根過氧化物酶標(biāo)記含游離羧基的半抗原，通常采用碳二亞胺法、活性酯法或混合酸酐法。用辣根過氧化物酶標(biāo)記含有游離氨基的半抗原可采用戊二醛法、二異硫氰酸酯法等。需要注意的是，辣根過氧化物酶催化過氧化物釋放活性氧，一些化學(xué)性質(zhì)不夠穩(wěn)定、容易被氧化的半抗原(如酚類化合物等)在與辣根過氧化物酶共價耦聯(lián)的過程中要注意避光避氧，防止半抗原被氧化后導(dǎo)致相應(yīng)抗體無法識別。

酶標(biāo)半抗原的純化可采用透析、超濾離心法。小分子標(biāo)記物標(biāo)記的半抗原可采用薄層色譜、柱色譜法分離純化。

2、抗原的標(biāo)記與純化

抗原的標(biāo)記視抗原的種類和特性而定。在農(nóng)藥免疫分析中，所用的抗原是人工合成的(半抗原與載體蛋白的耦聯(lián)物)，因此標(biāo)記物可以標(biāo)記在人工抗原的載體蛋白上。蛋白質(zhì)類抗原的標(biāo)記、純化，與抗體的標(biāo)記、純化方法類似。

3、抗體的標(biāo)記與純化

抗體的標(biāo)記根據(jù)標(biāo)記物的不同采用不同的標(biāo)記方法。辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體常采用改良的過碘酸鹽法，即將辣根過氧化物酶分子中糖的醇羥基氧化成醛基后與抗體的游離氨基共價耦聯(lián)。分子中含游離羧基(如生物素等)、游離氨基的標(biāo)記物(如辣根過氧化物酶)與抗體的耦聯(lián)方法類似于含游離羧基、氨基的半抗原與載體蛋白的共價耦聯(lián)。含芳香族伯胺的標(biāo)記物，采用重氮化法與抗體分子中酪氨酸殘基的酚羥基鄰位形成偶氮鍵連接。含異氰酸酯結(jié)構(gòu)的標(biāo)記物可與抗體的游離氨基直接耦聯(lián)。為防止標(biāo)記物耦聯(lián)在抗體的抗原結(jié)合部位而導(dǎo)致抗體的免疫學(xué)活性降低，可采用馬來酰亞胺類活性酯等方法將標(biāo)記物與單鏈抗體的巰基共價連接，因為抗體的抗原結(jié)合部位不含巰基。納米金標(biāo)記抗體則采用物理吸附法。

由于標(biāo)記物的分子大小不同，標(biāo)記抗體的純化方法也不同。如標(biāo)記物為小分子化合物，標(biāo)記抗體的純化可采用透析、離心超濾法。若標(biāo)記物為大分子(如辣根過氧化物酶)，標(biāo)記抗體的純化通常采用Sephadex凝膠柱色譜法。如用小分子標(biāo)記物標(biāo)記半抗原，可采用薄層色譜、硅膠柱色譜法分離純化。

(五)免疫分析技術(shù)的建立與條件優(yōu)化

1、抗原和抗體的濃度選擇

抗原抗體反應(yīng)中，抗體的濃度需與抗原濃度相適應(yīng)，通常采用方陣實驗法篩選抗原抗體的最適濃度組合。

(1)間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法中包被原和抗體濃度的選擇，對于問接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法，包被原和抗體濃度的選擇步驟如下。

①包被：將包被原用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液倍比稀釋成一定的濃度系列，100μL/孔，包被酶標(biāo)板不同的行，空白對照孔加等體積緩沖液，4℃下吸附過夜。

②封閉：次日傾去包被液，洗滌去除游離物，加封閉液150μL/孔，37℃下封閉1.5 h。洗滌去除游離物。

③反應(yīng)：將抗體用適當(dāng)pH的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PB)倍比稀釋至一定濃度系列加入酶標(biāo)板的不同列，100μL/孔，37℃下反應(yīng)1～1.5 h。洗滌去除游離物。

④加酶標(biāo)二抗：將酶標(biāo)二抗稀釋至工作濃度，加至酶標(biāo)板，100μL/TL，37℃下反應(yīng)1～1.5 h。洗滌去除游離物。

⑤顯色測定：加底物與顯色劑混合液100μL/孔，37℃下避光反應(yīng)15 min。加50μL/孔終止劑終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定各孔的吸光值。

分別以包被原濃度和抗體濃度為橫坐標(biāo)、以吸光值為縱坐標(biāo)作圖。選擇吸光值約為1.0抗原和抗體濃度都較低、處于吸光曲線拐點處的抗原和抗體濃度為最適濃度組合。

(2)包被抗原直接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法中包被原和酶標(biāo)抗體濃度的選擇在包被抗原直接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法中，包被原和酶標(biāo)抗體濃度的選擇步驟如下。

①包被：將包被原用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液倍比稀釋成一定的濃度系列，包被酶標(biāo)板的不同行，100μL/TL，空白對照孔加等體積緩沖液，4℃下吸附過夜。

⑦封閉：次日傾去包被液，洗滌去除游離物，加封閉液150μL/TL，37℃下封閉1.5 h。洗滌去除游離物。

③反應(yīng)：將酶標(biāo)抗體倍比稀釋成工作濃度系列，加至酶標(biāo)板的不同列，100μL/孔，37℃下反應(yīng)1～1.5h。洗滌去除游離物。

④顯色測定：加底物與顯色劑混合液100μL/孔，37℃下避光反應(yīng)15min，加終止劑50μL/孔終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定各孔的吸光值。

分別以包被原濃度和酶標(biāo)抗體濃度為橫坐標(biāo)、以吸光值為縱坐標(biāo)作圖。選擇吸光值約為1.0處于吸光曲線拐點處的包被原和酶標(biāo)抗體濃度為最適濃度組合。

(3)包被抗體直接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法中抗體和酶標(biāo)半抗原濃度的選擇在包被抗體直接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法中，抗體和酶標(biāo)半抗原濃度的選擇步驟如下。

①包被：將抗體用適當(dāng)pH的磷酸鹽緩沖液倍比稀釋成一定的濃度系列并包被酶標(biāo)板的不同行，100μL/TL，空白對照孔加等體積磷酸鹽緩沖液，4℃下吸附過夜。

②封閉：次日傾去包被液，洗滌去除游離物，加封閉液150 μL/TL，37℃下封閉1.5 h。洗滌去除游離物。

③反應(yīng)：將酶標(biāo)半抗原用磷酸鹽緩沖液倍比稀釋成一定濃度系列并加至酶標(biāo)板的不同列，100μL/TL，37℃下反應(yīng)1～1.5 h。洗滌去除游離物。

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