1.5.2.6 抑菌試驗(yàn)

驗(yàn)利用牛津杯抑菌圈法測(cè)定植物乳桿菌ZJ316、副干酪乳桿菌ZFM54、沙克乳桿菌ZFM225的抑菌性質(zhì)。將活化后的3株乳酸菌，按3％的接種量接至草石蠶菜汁培養(yǎng)基。于37℃培養(yǎng)24h。草石蠶發(fā)酵液于8000r/min離心5min(4℃)，取上清液備用。將抑菌試驗(yàn)所需的指示菌在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，按1％的接種量接入50℃左右融化的半固培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入牛津杯的平板上，待完全冷卻后拔出牛津杯。用移液槍吸取150μL發(fā)酵上清液加入孔洞中，37℃培養(yǎng)12h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

1.5.2.7 產(chǎn)葉酸能力測(cè)

定利用德國(guó)拜發(fā)IFP維生素B₉葉酸微生物法試劑盒對(duì)發(fā)酵樣品中的葉酸含量進(jìn)行測(cè)定。按試劑盒中說(shuō)明書(shū)要求對(duì)樣品進(jìn)行處理，將處理后的樣品與培養(yǎng)基加入試劑盒自帶的微孔板中，用粘合箔封緊后于37℃黑暗條件下培養(yǎng)48h。培養(yǎng)完成后從培養(yǎng)箱中取出微孔板，再次壓緊粘合膜并在桌面上震蕩，使微生物在培養(yǎng)基中混合均勻。隨后輕輕撕下粘合膜，破壞微孔中的所有泡沫，并用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)540nm處測(cè)定微孔的0D_540nm值。

1.5.2.8 菌株發(fā)酵草石蠶菜汁產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

1)樣品處理

將活化后的植物乳桿菌ZJ316、沙克乳桿菌ZFM225、副干酪乳桿菌ZFM54按3％的接種量接種于草石蠶菜汁培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后取10mL裝入15mL頂空進(jìn)樣瓶中。將頂空進(jìn)樣瓶放到50℃水浴鍋內(nèi)加熱30min，備用。

2)頂空固相微萃取條件

將老化后的萃取頭插入進(jìn)樣瓶頂空部分，50℃平衡30min、吸附30min后，將萃取頭取出并插GC進(jìn)樣口。同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)，解吸20min。

3)GC-MS條件

7890A/5975GC，MS聯(lián)用儀；色譜柱：HP-5MS型(30m×0.250mm×0.25μm)；載氣：氦氣；進(jìn)樣溫度：230℃；進(jìn)樣量：1μL；升溫程序：初溫45℃保持2min，以5℃/min速率上升至180℃，保持1min后以25℃/min速率升到230℃，保持5.5min。

4)數(shù)據(jù)處理

由計(jì)算機(jī)質(zhì)譜系統(tǒng)NSIT檢索未知化合物。匹配度大于70％的結(jié)果將予以報(bào)告，采用面積歸一法計(jì)算各成分的含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

上述所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)分析使用Origin9.0處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的初步篩選

乳酸菌在草石蠶菜汁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，不僅能夠反映出乳酸菌對(duì)草石蠶菜汁發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)能力，也是乳酸菌發(fā)酵性能分析的基礎(chǔ)，因此本研究通過(guò)生長(zhǎng)情況測(cè)定初步篩選出優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株。如圖1所示，培養(yǎng)24h后，植物乳桿菌ZJ316、副干酪乳桿菌ZFM54、沙克乳桿菌ZFM225在草石蠶菜汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況最好，0D_600nm、值分別為1.84，1.64，1.58，本研究選擇這3株乳酸菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 發(fā)酵性能的測(cè)定

2.2.1 最佳接種量的確定

接種量的多少與乳酸菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況密切相關(guān)，過(guò)小的接種量會(huì)導(dǎo)致乳酸菌生長(zhǎng)密度偏低，而接種量過(guò)高則會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)匱乏導(dǎo)致菌體死亡的現(xiàn)象，因此確定一個(gè)最優(yōu)的接種量非常重要。如圖2所示，植物乳桿菌ZJ316在3％接種量處有最高活菌數(shù)8.7×10⁸CFU/mL、沙克乳桿菌ZFM225在3％接種量處有最高活菌數(shù)1.7×10⁸CFU/mL、副干酪乳桿菌ZFM54在3％接種量處有最高活菌數(shù)2.3×10⁸CFU/mL。因此，植物乳桿菌ZJ316、沙克乳桿菌ZFM225、副干酪乳桿菌ZFM54的最佳接種量均為3％。

2.2.2 生長(zhǎng)特性

如圖3所示，本次研究篩選出3株益生功能型乳酸菌ZJ316、ZFM225、ZFM54均能很好的適應(yīng)草石蠶菜汁培養(yǎng)基的發(fā)酵環(huán)境，這3株乳酸菌均在培養(yǎng)8h達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期，16h達(dá)到平穩(wěn)期。其中以植物乳桿菌ZJ316的生長(zhǎng)情況最為良好，培養(yǎng)24h后0D_600nm值可達(dá)到1.824。

2.2.2 生長(zhǎng)特性

如圖3所示，本次研究篩選出3株益生功能型乳酸菌ZJ316、ZFM225、ZFM54均能很好的適應(yīng)草石蠶菜汁培養(yǎng)基的發(fā)酵環(huán)境，這3株乳酸菌均在培養(yǎng)8h達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期，16h達(dá)到平穩(wěn)期。其中以植物乳桿菌ZJ316的生長(zhǎng)情況最為良好，培養(yǎng)24h后0D_600nm值可達(dá)到1.824。

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