牛舌草為紫草科植物意大利牛舌草AnchusaitalicaRetiz．或琉璃苣BoragoofficinalisL．的地上部分，是我國新疆地區(qū)常用藥材，牛舌草藥材收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》維藥分冊，用于治療心悸，失眠，神志不安，頭痛，反應(yīng)遲鈍，是愛維心口服液等制劑中的主藥，同時，琉璃苣(BoragoofficinalisL．)也是一種可以食用的植物，其新鮮植物體可以作為蔬菜煮食，也可作為芳香調(diào)味料使用。研究表明，牛舌草提取物具有抗氧化、抗癌、防治哮喘和阿爾茨海默病的作用，經(jīng)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)牛舌草含有豐富的多糖類成分，但目前未見深入研究報道。植物多糖具有多種生物活性，包括抗癌、降血糖等。本文著眼于對牛舌草多糖類成分的提取和含量測定，并研究了牛舌草多糖體外抗DNA氧化損傷作用，為將來進一步研究牛舌草的化學(xué)成分和藥理活性奠定基礎(chǔ)工作。

一、材料與方法

1、材料與試劑

牛舌草購自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達教授鑒定為紫草科植物琉璃苣BoragoofficinalisL。

葡萄糖對照品(SigmaG8270，純度＞98％)；鯡魚精DNA(北京索萊寶科技有限公司，生物試劑，純度99.5％)；蒽酮(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)，硫酸(天津市永晟精細(xì)化工有限公司，分析純)；乙醇(天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，分析純)；蒸餾水(實驗室自制，18.2MΩ·cm^-1)。

2、主要儀器設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；KQ-700DV型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-S4數(shù)顯水浴鍋(金壇醫(yī)療儀器廠)；ABl04—N型電子天平(Meller—ToledoInsterLTD)。

3、方法

（1）牛舌草多糖的制備

取牛舌草粉末經(jīng)3倍量石油醚回流3次，每次3h，藥渣揮干后用3倍量的95％乙醇回流3次，每次3h，藥渣揮干后取0.5g加蒸餾水20mL超聲提取3次，每次30min，提取液過濾合并后濃縮至10mL，Sevag法(氯仿：正丁醇5∶1)除去蛋白質(zhì)，加無水乙醇至80％進行沉淀，離心后得到的多糖沉淀用無水乙醇、丙酮，乙醚反復(fù)洗滌后干燥，得精制多糖。

（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

精密稱取葡萄糖對照品50.05mg在50mL容量瓶中用蒸餾水溶解，隨后定容至刻度，得葡萄糖對照品溶液，其濃度為1.001mg/mL的。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液2、3、4、5、6mL分別置于25mL容量瓶中用蒸餾水定容，各取1mL系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至具塞試管中，以1mL蒸餾水作空白，硫酸蒽酮一硫酸法顯色，并在620nm處測定吸光度值，以葡萄糖對照品得濃度(mg/mL)對其吸光度A進行回歸后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A=28.55C+0.0062，R²=O.9995，線性范圍：0.01600—0.04800mg/mL。

（4）樣品溶液的配制

將牛舌草藥材粉末經(jīng)3倍量的石油醚和3倍量的95％乙醇分別回流3次，每次3h，脫色并除去單糖和寡糖，揮干溶劑并干燥后精密稱取藥材粉末0.5g置錐形瓶中，加入蒸餾水20mL，超聲提取30min，提取1次，離心得牛舌草多糖樣品溶液。

（5）換算因子的測定

精密稱取兩份精制牛舌草多糖，各10mg，在50mL容量瓶中用蒸餾水溶解后定容至刻度，精密吸取該溶液0.5mL，將牛舌草藥材粉末經(jīng)3倍量的石油醚和3倍量的95％乙醇分別回流3次，每次3h，脫色并除去單糖和寡糖，揮干溶劑并干燥后精密稱取藥材粉末0.5g置錐形瓶中，加入蒸餾水20mL，超聲提取30min，提取1次，離心得牛舌草多糖樣品溶液。每份溶液測定3次并按下面的公式計算換算因子：

f=w/(C×D)，

式中：w為多糖質(zhì)量，以mg計；C為多糖溶液中葡萄糖濃度，以mg/mL計；D為多糖稀釋因素，取兩者平均值，測得f=1.03。

(6)多糖含量的測定

精密吸取樣品溶液1mL置于10mL容量瓶中并用蒸餾水定容，混勻，取該溶液0.5mL在具塞試管中顯色，在620nm處測定吸光度。多糖含量=(c×D×f)/w×100％。其中w為多糖樣品的質(zhì)量，以g計；f為換算因子；C為多糖溶液中葡萄糖濃度，以mg/mL計；D為多糖稀釋因素。

(7)精密度實驗

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液4mL在25mL容量瓶中稀釋定容，并取該溶液1mL在具塞試管中顯色，重復(fù)測定6次，RSD為0.23％，表明儀器精密度良好。

(8)穩(wěn)定性實驗

按樣品溶液制備方法制備一批樣品，分別測定0、1、2、3、4、5、6h的吸光度，計算多糖含量，RSD為2.33％，表明樣品溶液6h內(nèi)穩(wěn)定。

(9)重復(fù)性試驗

根據(jù)精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液2、3、4、5、6mL分別置于25mL容量瓶中用蒸餾水定容，各取1mL系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至具塞試管中，以1mL蒸餾水作空白，硫酸蒽酮一硫酸法顯色，并在620nm處測定吸光度值，以葡萄糖對照品得濃度(mg/mL)對其吸光度A進行回歸后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A=28.55C+0.0062，R²=O.9995，線性范圍：0.01600—0.04800mg/mL。項下的方法制備10份樣品溶液，測定各溶液中的多糖含量，其RSD為2.11％，表明方法精密度良好。

(10)加樣回收率試驗

(11)響應(yīng)面法優(yōu)化實驗設(shè)計

選取料液比，提取時間，超聲功率，提取次數(shù)四個因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上利用Design—Expert8.0.6軟件設(shè)計四因素三水平實驗，各因素和水平如表2中所示，響應(yīng)面設(shè)計和實驗結(jié)果如表3中所示。

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