酶活力對AFs降解率的影響:將酶活力分別為1、2、3、4U和5U的漆酶分別與10μL0.1mg/mL的AFB1標準溶液渦旋振蕩混勻，30℃、200r/min孵育12h。對照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的PBS₁其他條件相同。所有實驗重復3次，降解率按式（1）計算:

（8）AFs的提取

將孵育時間對AFs降解率的影響:將酶活力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標準溶液渦旋振蕩混勻，置于30℃、200r/min分別孵育12、24、36、48h和60h。對照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffersaline，PBS），其他條件相同。孵育溫度對AFs降解率的影響:將酶活力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標準溶液渦旋振蕩混勻，分別置于25、30、35、40℃和45℃溫度下，200r/min孵育12h。對照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的PBS，其他條件相同。酶活力對AFs降解率的影響:將酶活力分別為1、2、3、4U和5U的漆酶分別與10μL0.1mg/mL的AFB₁標準溶液渦旋振蕩混勻，30℃、200r/min孵育12h。對照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的PBS₁其他條件相同。處理的樣品12000r/min離心30s，使管壁上的發(fā)酵液離心至管底部，并轉移至10mL的具塞玻璃管中，向玻璃管中加入等體積的三氯甲烷（在通風處進行），渦旋振蕩10min使其充分混勻，然后倒入離心管中，靜置30min分層，取上層液體于玻璃管中，加入等體積三氯甲烷，吸取下層有機相清液于離心管中，相同操作重復3次。合并3次有機相于氮吹管中，于45℃氮氣吹干。再用甲醇溶液溶解出AFs，并用0.22μm濾膜過濾。

（9）HPLC-MS/MS檢測AFs及標準曲線的繪制

配制的毒素標準溶液和提取的毒素溶液均用0.22μm濾膜過濾至液相小瓶中。

HPLC條件:液相模塊為安捷倫1260Infinity:Inertsil0DS-3C18色譜柱（150mmX4.6mm，3μm）；流速0.2mL/min；進樣量5μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為甲醇-水（3:7，V/V）；分析時間30min；檢測溫度30℃。

MS/MS條件:電噴霧離子源:監(jiān)測模式:多反應監(jiān)測；離子源溫度300℃:錐孔電壓15psi；碰撞電壓135V；碰撞能量30eV:毛細管電壓4kV；質量掃描范圍m/z313.0～285.0。

（10）響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，以孵育時間、孵育溫度和酶活力作為考察因素，以AFB₁降解率為響應值，響應面試驗設計因素與水平如表1所示。

（11）AFB₁降解產物的測定及結構解析

HPLC條件:ZORBAX-SBC18色譜柱（100mmX2.1mm，3.5μm）。流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為0.1%甲酸-甲醇溶液。梯度洗脫程序:40%B，6min；60%B，維持16min；100%B，8min；總共運行30min。進樣量5μL，流速0.4mL/min，柱溫箱30℃。

MS條件:霧化氣GS1壓力50psi；霧化氣GS2壓力50psi；氣簾氣壓力35psi；離子源溫度550℃:離子源，電壓5500V；一級掃描去簇電壓100V；聚焦電壓10V；質量掃描范圍m/z100～1500；二級掃描采用TOFMS-Productlon-IDA模式采集質譜數(shù)據(jù)，誘導碰撞解離能量分別為20、40V和60V，進樣前，用蠕動泵做質量軸校正，使質量軸誤差小于0.002%。

二、結果與分析

1、漆酶的同源模建結果

在本實驗所用漆酶晶體結構未被解析的情況下，利用某些已知漆酶晶體結構的基礎上同源模建可以，最大程度上獲得理想的目的蛋白三維結構。利用ChemBioDraw2014軟件以及MOEv2014.0901軟件繪制并轉換成三維結構，如圖1所示。研究AFs與該酶的結合模式首先需要構建同源模型，結果如表2和圖2所示。圖3分析顯示，99%的漆酶殘基位于蛋白構像的合理區(qū)域，這表明本實驗構建的漆酶同源模型符合立體化學規(guī)則，具有合理性。

2、漆酶與AFB₁的相互作用分析

采用分子對接手段研究AFB₁與栓菌漆酶表面的相互作用，旨在分析AFB₁與漆酶相互作用模式。為明確漆酶和毒素的結合模式，采用誘導契合的策略，根據(jù)配體的構象側鏈受體口袋允許移動適應，將毒素分別對接到漆酶的活性部位，得到漆酶活力位點與配體的結合模式，如圖4所示，對接打分為-6.4532kca/mol。
 

根據(jù)所構建的對接模型，如圖4所示，AFB₁上甲氧基的氧原子可作為氫鍵的受體，與漆酶上一個高度保守同時也靠近銅離子（T1CuI）位置的His481上氨基酸側鏈形成氫鍵，另外，AFB₁呋喃環(huán)上的氧原子也可以作為氫鍵的受體，與漆酶Asn288的側鏈形成氫鍵，因此，His481和Asn288是漆酶和AFB₁結合時的關鍵氨基酸位點，通過氫鍵相互作用。

酶-配體的結合親和力與其相互作用的效率有關，受到配體的結構特征和扭曲程度以及配體和酶表面之間形狀互補的影響。有研究表明氫鍵是酶與配體相互作用的關鍵作用力，參與氫鍵形成的氨基酸殘基被認為是漆酶與小分子配體相互作用的關鍵殘基。其中氧原子與氨基酸殘基形成的氫鍵作用強于碳原子與氨基酸殘基形成的氫鍵，且氫鍵鍵長越短，作用越強。對接模擬研究表明，存在于T1銅配位層中的保守的殘基His481最可能與AFs發(fā)生相互作用，形成氫鍵，推測其可以介導氧化過程中的電子轉移，提高電子傳遞效率，從而提高漆酶催化能力。綜合多方面原因造成酶對毒素的作用能力存在差異，表現(xiàn)為對接分數(shù)不同。

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