3苦參中苦參堿和氧化苦參堿含量測(cè)定

3.1色譜條件

3.1.1流動(dòng)相的考察

曾參考《中國(guó)藥典》2015年版一部第202頁(yè)苦參項(xiàng)下收載的苦參堿和氧化苦參堿含量測(cè)定色譜條件，以乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液（80∶10∶10）為流動(dòng)相，流速為每分鐘1 mL，柱溫設(shè)置為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)λ=220 nm，結(jié)果供試品色譜中苦參堿和氧化苦參堿色譜峰分離度差或是存在峰形不好的現(xiàn)象，經(jīng)摸索，對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整為以乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液（84∶7∶9）為流動(dòng)相，柱溫設(shè)置為40 ℃，其他色譜條件不變，供試品中苦參堿和氧化苦參堿色譜峰能達(dá)到基線分離，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，

3.1.2流動(dòng)相流速的考察

分別考察了流動(dòng)相流速為每分鐘0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL苦參堿和氧化苦參堿色譜峰的分離效果，結(jié)果在三種不同流速情況下均可達(dá)到基線分離，綜合考慮分析時(shí)間、分離度、色譜峰峰形、儀器分析壓力等因素，本實(shí)驗(yàn)確定流速為每分鐘1 mL 。

3.1.3柱溫的考察

分別考察了柱溫設(shè)置為30 ℃、35 ℃、40 ℃時(shí)，苦參堿和氧化苦參堿色譜峰的分離情況，結(jié)果三個(gè)不同柱溫條件下均可達(dá)到分離，綜合考慮分離度、分析時(shí)間、峰形等因素，本實(shí)驗(yàn)確定柱溫為40 ℃。

3.1.4色譜柱的考察

分別考察了菲羅門Luna NH2柱、Waters Xbridge BEH Amide色譜柱、Agilent Zorbax NH2柱(規(guī)格：4.6 mm×250 mm，粒徑：5 µm)]色譜峰分離效果，結(jié)果前兩根色譜柱存在分離度或峰形差的現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)最終采用了Agilent Zorbax NH2柱。

3.1.5色譜條件的確定

以氨基鍵合硅膠為填充劑[ Agilent Zorbax NH2柱 (規(guī)格：4.6 mm×250 mm，粒徑：5 µm)]，配制乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液體積比為（84∶7∶9）的溶液作為流動(dòng)相，流速為每分鐘1.0 mL；柱溫為40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)λ=220 nm。

3.2苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液的配制

①精密稱取苦參堿（110805-200306）10.90 mg，置10 mL量瓶中，加乙腈∶無(wú)乙醇（80∶20）的混合溶液溶解，并稀釋定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含1.09 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

②精密稱取氧化苦參堿（110780-201007，以92.3%計(jì)）12.06 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈∶無(wú)乙醇（80∶20）的混合溶液溶解，并稀釋定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.4452 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

3.3供試液的制備

分別考察了樣品是否離心、加濃氨試液搖勻后是否靜置、以及三氯甲烷提取次數(shù)（3次、4次、5次）對(duì)苦參堿和氧化苦參堿提取效果的影響，綜合考慮苦參堿和氧化苦參堿含量及提取操作過(guò)程中乳化現(xiàn)象情況，最終確定供試液的制備方法如下：

精密量取參柏洗劑離心（3000 r/min，5min）后的上清液10 mL，置分液漏斗中，加入濃氨試液0.5 mL，搖勻，加三氯甲烷振搖提取4次，20 mL/次，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，即得。

3.4分析方法驗(yàn)證

3.4.1專屬性考察

取苦參陰性對(duì)照樣品，照供試液制備的方法制得陰性對(duì)照溶液。分別精密吸取苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液、參柏洗劑供試品溶液、苦參陰性對(duì)照溶液各5 µL，按“3.1.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果苦參陰性液相色譜圖在與對(duì)照品和供試品液相色譜圖相同保留時(shí)間位置上無(wú)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明該含量測(cè)定方法專屬性較好，見圖4。

3.4.2線性考察

①分別精密吸取苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液（1.09 mg/mL）0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，放置2 mL量瓶中，加乙腈∶無(wú)水乙醇（80∶20）稀釋至刻度，制得濃度分別為0.109 mg/mL、0.218 mg/mL、0.436 mg/mL、0.654 mg/mL、0.872 mg/mL、1.09 mg/mL的苦參堿對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，按“3.1.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積的積分值Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣苦參堿量X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=435.908542X-20.675117（r=0.99988），表明苦參堿進(jìn)樣量在0.545 μg～5.45 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

②分別精密吸取氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.4452 mg/mL）0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，放置5 mL量瓶中，加乙腈∶無(wú)水乙醇（80∶20）稀釋至刻度，制得濃度分別為0.04452 mg/mL、0.08904 mg/mL、0.17808 mg/mL、0.26712 mg/mL、0.35616 mg/mL、0.4452 mg/mL的氧化苦參堿對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，按“3.1.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積的積分值Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣氧化苦參堿量X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=435.908542X-20.675117（r=0.99993），表明氧化苦參堿進(jìn)樣量在0.2226 μg～2.226 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

3.4.3精密度考察

精密吸取參柏洗劑（批號(hào)：20200501）供試品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照“3.1.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算苦參堿色譜峰面積RSD值為0.18%（n=6），氧化苦參堿色譜峰面積RSD值為0.99% (n=6)，表明所用儀器設(shè)備精密度較好。

3.4.4穩(wěn)定性考察

取參柏洗劑（批號(hào)：20200501）供試品溶液，分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、21 h、24 h小時(shí)進(jìn)樣5 μL，按照“3.1.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算苦參堿色譜峰面積RSD值為0.50% （n=8），氧化苦參堿色譜峰面積RSD為1.08%（n=8），表明該含量測(cè)定供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4.5重復(fù)性試驗(yàn)

按擬定的含量測(cè)定方法，對(duì)同一批參柏洗劑(批號(hào)：20200501)分別制備6份供試液，按照“3.1.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果苦參堿平均含量為0.2330 mg/mL，RSD為1.92%（n=6），氧化苦參堿平均含量為0.0448 mg/mL，RSD為1.43%（n=6），苦參堿和氧化苦參堿總和平均含量為0.2778 mg/mL，RSD為1.82%（n=6），表明所建含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

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