1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采集：使用Analyst數(shù)據(jù)處理軟件，將30種化合物離子對信息、液相條件及質(zhì)譜參數(shù)輸入軟件建立檢測方法，經(jīng)ScheduledMRM→IDA→EPI掃捕模式采集到各化合物的XIC質(zhì)譜圖和EPI質(zhì)譜圖，分別用于定量和定性分析。

譜庫建立：創(chuàng)建Analyst與譜庫的連接，打開譜庫編輯記錄，選擇各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的EPI質(zhì)譜圖，輸入化合物信息，形成30種化合物的EPI據(jù)庫。

搜庫匹配：打開樣品數(shù)據(jù)，點擊樣品的EPI質(zhì)譜圖，選擇自動搜索，獲得軟件自動搜庫比對信息，根據(jù)匹配結(jié)果判定是否陽性。

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動相的選擇

本實驗為了兼顧正、負離子同時掃描模式的響應(yīng)，選用乙腈-乙酸銨溶液作為洗脫溶劑。作為流動相乙腈比甲醇的洗脫能力強，而流動相中加入緩沖溶液可以改善峰型、抑制拖尾，得多種化合物最佳的分離效果和檢測靈敏度，實驗考察了三種乙酸銨緩沖溶液濃度5mmol/L（a）、10mm01/L（b）、20mm01/L（c）對30種化合物洗脫效果的影響?？疾旖Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用a溶液為流動相時，色譜峰邊緣出現(xiàn)“毛刺”，峰型較差，響應(yīng)較低；以c溶液為流動相時，色譜峰峰型變寬，影響定最準(zhǔn)確性；以b溶液為流動相時，色譜峰峰型較其他兩組尖銳，同時響應(yīng)也最高。因此，實驗選用乙腈-10mm01/L乙酸銨溶液作為流動相。

2.1.2色譜柱的選擇

由于本方法檢測的化合物種類較多，流動相為極性，pH為中性，C₁₈柱是非極性鍵合相的色譜柱且應(yīng)用范圍廣，多化合物分離效果好，因此選用C₁₈柱作為實驗用色譜柱?；?0種目標(biāo)化合物在該類色譜柱中具有不同保留能力，所以可以實現(xiàn)良好的分離。實驗考察了三種C18柱，A柱為waLersSunFireC₁₈（100mm×2.1mm，5μm）、B柱為AgilentZORBAXEcliPseXDB-C₁₈（150mm×2.1mm，3.5μm）、C柱為PhenomenexKinetexC₁₈（50mm×2.1mm，2.6μm）的分離效果。實驗結(jié)果顯示：使用A、B柱分離時，30種化合物色譜峰整體出峰數(shù)量較少，峰型較寬、分離度較差；C柱與A、B柱相比，色譜峰出峰時間總體縮短，出峰數(shù)量最多，峰型較窄，分離度最好。因此本方法選用PhenomenexKinetexC₁₈（50mm×2.1mm，2.6μm）柱作為色潛柱。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將稀釋好的50ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下，根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特性，分別采用正離子和負離子掃描：首先，進行全掃描（Scan）模式，根據(jù)30種目標(biāo)化合物的分子量，確定掃描質(zhì)量范圍，逐一確定每種物質(zhì)的最佳母離子質(zhì)荷比（Q1）；然后，根據(jù)獲得的Ql，進行子離子（Q3）的掃捕，選擇響應(yīng)較高干擾較少的兩個離子對作為定景和定性離子對，分別優(yōu)化它們的錐孔電壓（DP）和碰撞能量（CE）等質(zhì)譜參數(shù)，使離子對響應(yīng)強度最大。

2.2.2采集方式的選擇

根據(jù)MRM采集方式的計算公式：色譜峰寬（本方法為12s）=采集點數(shù)×一次掃描時間，由于化合物準(zhǔn)確定量要求色譜峰采集點數(shù)在15個以上，按照常規(guī)MRM采集方式：一次掃描時問=（駐留時間+通道切換時間5ms）×掃描離子對個數(shù)，本方法需要掃描60個離子對，計算得到駐留時間為最多為8ms，掃描時問較短，響應(yīng)值偏低。本方法建立了ScheduledMRM模式下的正、負離同時掃描：在每個化合物的離子對通道中輸入相應(yīng)出峰時間，選擇掃描模式（正、負），設(shè)置MRM檢測窗口時間為40s，掃描時間為0.6s，即在設(shè)置的化合物保留時間±20s范圍進行離子掃描，檢測到的離子對總的掃描時間為0.6s。則本方法采集點數(shù)為20個，最多一次需要掃捕16個離子對，因此每個離子對駐留時問最少為32ms，與常規(guī)MRM采集方式相比獲得的色譜峰峰型更好，響應(yīng)更強，靈敏度更高，定量準(zhǔn)確性更強。ScheduledMRM采集方式使得每對MRM離子的檢測只在相應(yīng)的色譜保留時間內(nèi)進行，每對MRM都有最恰當(dāng)?shù)难h(huán)時問和駐留時間，確保了定量分析的重現(xiàn)性和數(shù)據(jù)的可靠性。各化合物特征離子圖，見圖1。

2.2.3掃描模式的選擇

本方法選用ScheduledMRM→TDA→EP掃描模式，在建立好30種化合物的ScheduledMRM模式基礎(chǔ)上，設(shè)置篩選條件（IDA），包括增強子離子掃描（EPI）掃描速度：1000Da/s，EPI掃捕范同：50～650Da，設(shè)置EPI參數(shù)，包括碰撞能量（CE）：（35±15）V；去簇電壓（DP）：80V。觸發(fā)SchedulecdMRM→IDA→EPI模式系統(tǒng)根據(jù)設(shè)置的篩選條件自動判斷，經(jīng)探測掃描，當(dāng)采集到的化合物信號強度超過預(yù)設(shè)的值（即出現(xiàn)色譜峰）則系統(tǒng)自動切換（＜1ms）到離子阱模式，進行增強子離子掃描（EPI），獲得相應(yīng)母離子的高質(zhì)量MS2圖譜（含低、中、高三種能量下的復(fù)合二級圖譜），從而形成該化合物的“指紋”圖譜”。如果響應(yīng)強度未達到預(yù)設(shè)值則只運行ScheduledMRM采集模式。該模式對目標(biāo)化合物進行一次掃描，就能獲得高靈敏度、高選擇性MRM采集信息，用于準(zhǔn)確定量；若觸發(fā)EPI掃捕，還可在線采集EPI圖譜，用于確證和結(jié)構(gòu)分析。實現(xiàn)了對目標(biāo)化合物同時定性定量，從而減少了分析步驟，縮短分析時間。如圖2，30種目標(biāo)化合物的母離子在EPI掃描模式下形成質(zhì)譜圖，該質(zhì)譜圖為疊加三種不同碰撞能量下二級碎片離子質(zhì)譜圖，其響應(yīng)值為三者的平均值。每種化合物的EPI質(zhì)譜圖都具有特征性且響應(yīng)較好，用于建立EPI數(shù)據(jù)庫，使樣品圖譜可進行搜庫分析，提高定性準(zhǔn)確度。

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相關(guān)鏈接：乙酸銨，乙腈，C18柱