2 液相色譜

高效液相色譜(HPLC)具有高效、快速、靈敏度高、重復性好等特點，是化合物純度鑒定和生物大分子分析的通用分析方法。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)在保留色譜技術高效分離優(yōu)勢的同時，通過MS獲得待測組分豐富的結構信息，在藥物代謝、復雜基質(zhì)單一成分鑒定、代謝組學研究等方面凸顯優(yōu)勢。

2.1 新型冠狀病毒候選藥物評估

Zhang等報告了冠狀病毒藥物靶標Mpro與α-酮酰胺抑制劑復合物的X射線結構，通過LC-MS/MS分析確定α-酮酰胺抑制劑13a和13b具有明顯的肺向性。Jin等利用計算機輔助藥物設計篩選Mpro抑制劑，測定了 10 000 多種藥物或活性化合物，并利用LC-MS/MS分析確定依布硒啉、PX-12和卡莫呋對Mpro的共價結合。Ma等將非變性質(zhì)譜(native MS)用于Mpro與4種潛在抑制劑(波普瑞韋、GC-376以及鈣蛋白酶抑制劑II和XII)的結合表征，結果發(fā)現(xiàn)此4種化合物均能明顯抑制SARS-CoV-2在細胞內(nèi)復制。Maisonnasse等基于LC-MS/MS研究了羥氯喹(HCQ)在體外和SARS-CoV-2感染獼猴中的抗病毒活性，通過定量分析血清、血液以及肺組織中HCQ含量，發(fā)現(xiàn)HCQ沒有明顯的預防感染能力。

2.2 復雜基質(zhì)單一成分鑒定

Dai研究組針對SARS-CoV-2主要蛋白酶Mpro設計合成了兩種先導化合物11a和11b, 通過HPLC鑒定其純度，分別為99.88%和99.20%,這兩種化合物在體內(nèi)均表現(xiàn)出有效的抗SARS-CoV-2感染活性，可作為候選藥物用于后續(xù)臨床研究。Monteil等使用HPLC鑒定了鼠源重組ACE2,并比較了鼠源重組與人重組ACE2在SARS-CoV-2抗感染方面的差異。結果表明，人重組ACE2可顯著降低細胞和多種人體器官模型的病毒感染，而鼠源重組ACE2則沒有此效果。在對患病程度不同的新冠病人及健康人員血清進行蛋白質(zhì)組學和代謝組學分析后，Shen等利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)從血清中分離鑒定并定量了894種蛋白質(zhì)和941種代謝物(包括36種藥物及其代謝物),揭示了重癥患者血清中特征蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的變化，為疾病嚴重程度評估提供參考。

3 磁珠分離

磁珠分離技術可通過磁性顆粒表面修飾的官能團或特異性抗體，從復雜基質(zhì)中選擇性結合靶標分子，并在外磁場輔助下實現(xiàn)目標物富集，其分離效率高、重復性好，但提取效率低且價格較高。當前，磁珠分離技術仍是新型冠狀病毒分離的主要方法，且有多款基于磁微粒-化學發(fā)光的檢測試劑盒通過國家藥監(jiān)局審批。該試劑盒采用雙抗原夾心原理，形成化學發(fā)光劑/抗原-抗體-磁顆粒/抗原復合物，在磁場輔助下分離結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物，隨后加入發(fā)光促進劑進行發(fā)光反應，通過對發(fā)光強度的檢測進行定量或定性分析。磁珠分離技術還能與病毒核酸自動化提取設備配套使用，對大批量樣本的核酸進行提取，方法操作簡單，極大節(jié)約了時間和人工成本，可顯著提高核酸的檢測效率。

在新型冠狀病毒研究中，磁珠分離技術主要應用于細胞分離、核酸提取和免疫學檢測。Cao等利用免疫磁珠從外周血單核細胞(PBMC)中負選分離到B細胞，并用結合腫瘤壞死因子受體超家族7(CD27)抗體的磁珠進一步分離得到CD27+記憶B細胞，通過高通量單B細胞測序?qū)π鹿诳祻推诨颊唧w內(nèi)中和抗體進行鑒定。Zhao等在磁性納米顆粒上涂覆了一層聚(氨基酯)-羧基，利用核酸與羧基之間強相互作用提取SARS-CoV-2的RNA。該方法將病毒遺傳物質(zhì)裂解、提取和結合步驟組合到一起，得到的納米顆粒-RNA復合物不需要額外洗脫即可引入后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR),極大提高COVID-19的診斷效率。Fabiani研究組以磁珠為免疫載體，堿性磷酸酶為免疫標記二抗，開發(fā)了一種唾液中SARS-CoV-2快速檢測的電化學免疫分析法。所建方法可用于唾液臨床樣本中S蛋白和核衣殼蛋白(N蛋白)的檢測，檢出限分別為19 ng/mL 和8 ng/mL。

4 離心

離心技術操作簡易，成本較低，是通過控制離心機轉(zhuǎn)速實現(xiàn)樣品中蛋白質(zhì)、核酸及細胞亞組分的分離。作為最基礎的分離技術，離心技術在新型冠狀病毒檢測中可用來分離血漿中的血清，用于抗體和抗原的檢測。在新型冠狀病毒實驗室研究環(huán)節(jié)，通過離心技術可分離鼻咽拭子中顆粒物質(zhì)以及未消化的死細胞和纖維碎片，并反復離心清洗來沉淀純化病毒核酸。相比于普通離心技術，超速離心技術具有更強的離心力場，可迅速實現(xiàn)小顆粒(如病毒顆粒、蛋白質(zhì)等)的沉降分離。Bao等使用超速離心從Vero E6病變細胞中沉淀獲得病毒顆粒，研究了SARS-CoV-2在表達人ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠中的致病性。Zost等將超速離心用于S蛋白假型慢病毒的分離，來測定兩種單克隆抗體的中和能力，結果顯示假病毒比野生型病毒具有更敏感的中和表型，證明在單克隆抗體效果測定中使用活病毒的必要性。此外，聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度梯度離心技術也被用于分離PBMC,以研究普通冠狀病毒和SARS-CoV-2的免疫學差異。

5 微納分離

材料科學和電子技術的進步帶動了微納分離技術發(fā)展，使其成為生物樣品分析的重要技術手段。微流控技術具有微型尺寸、樣品量小、快速擴散、比表面積大等優(yōu)勢，常與其他技術結合，用于SARS-CoV-2相關蛋白質(zhì)的高靈敏檢測。Lin等開發(fā)了一種微流控免疫芯片，結合自制熒光檢測器分析檢測了SARS-CoV-2 3種生物標志物(IgG、IgM和抗原)。該方法快速、靈敏、便捷，在15 min內(nèi)即可完成SARS-CoV-2檢測。Xiong研究組基于環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP),開發(fā)了一種便攜式LAMP-微流控集成系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用小型圓盤狀微流控芯片(81 mm),可在40 min內(nèi)同時識別7種已知人類冠狀病毒。Funari等將電沉積方法用于一種光微流體傳感平臺開發(fā)，通過比較金納米釘在抗原-抗體結合時局部折射率變化，在30 min內(nèi)實現(xiàn)1 μL血清樣品中SARS-CoV-2 S蛋白特異性抗體測定，檢出限低至0.08 μg/L(～ 0.5 pmol/L)。Tan研究組提出了一種便攜式化學發(fā)光微流體的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)技術，從候選蛋白質(zhì)中篩選出對SARS-CoV-2 S1蛋白具有高親和力和特異性的D006作為校準抗體，在15 min內(nèi)可對血清中低至2 ng/mL 的S1特異性IgG進行定量評估。此技術還被用于S1和N蛋白的高靈敏檢測(40 min),檢出限分別為4 pg/mL 和62 pg/mL。Lakshmanan等將微流控芯片技術用于體外抗凝治療的止血效果評估，設計了一種具有兩條正交通道的微流控裝置，其中一條通道作為血管模型，另一條通道用來模擬損傷部位止血塞的形成，用于識別潛在的抗凝靶點和試驗藥物，以此減輕COVID-19相關的血栓并發(fā)癥。

6 電泳

電泳技術利用帶電粒子在電場中移動速率不同而達到分離的技術，是生命分析領域重要分離手段之一。然而，在新型冠狀病毒研究中電泳的許多應用均可被分子生物學方法替代，且在實際檢測中相比于自動化設備和商品化試劑盒，其技術要求高，因而應用有限，亟待后續(xù)研究拓展。其中，瓊脂糖凝膠電泳(AGE)是應用較多的電泳技術，常被用于聚合酶鏈式反應(PCR)產(chǎn)物分析。Kim等對SARS-CoV-2的RNA基因組結構進行了解析，并用AGE方法驗證了測序發(fā)現(xiàn)的亞基因組RNA(sgRNAs),進而揭示基因在RNA基因組上的確切位置。Meza-Robles等提出一步嵌套式RT-PCR,不需要實時熱循環(huán)儀，通過AGE即可實現(xiàn)新型冠狀病毒的定量檢測。該技術使用4個物種特異性的診斷引物，可同時實現(xiàn)特定區(qū)域擴增和陽性對照。Si等對 2 188 例疑似COVID-19患者的鼻咽拭子樣本進行分析，使用RT-PCR檢測SARS-CoV-2, PCR片段分析結合毛細管電泳檢測12種病毒，以研究SARS-CoV-2和常見呼吸道病毒的流行病學規(guī)律，以此提高疑似COVID-19患者的診斷效率。

7 結論

新型冠狀病毒研究已取得一定進展，分離技術在其中發(fā)揮著重要作用。其中，AC和SEC廣泛用于病毒相關蛋白質(zhì)純化中；精密儀器制造業(yè)的發(fā)展，促使HPLC分離效率的提升，是完成高靈敏度、快速解決病毒代謝組學分析的關鍵手段；新材料和電子技術的進步，帶動磁珠和微納分離技術的靈敏度提升和應用范圍拓展，尤其是對化學試劑消耗降低，實現(xiàn)了對環(huán)境的友好，是解決細胞分析、核酸分離和免疫學檢測的首選技術；傳統(tǒng)的離心技術在病毒顆粒和細胞分離中發(fā)揮著不可替代的作用；電泳技術主要用于PCR產(chǎn)物分析。

當前，新型冠狀病毒檢測的難點主要集中在“假陽性”和“假陰性”結果上。作為新型冠狀病毒檢測的“金標準”,核酸檢測能檢測出處于窗口期的患者，但病毒載量差異、樣品采集、診斷試劑質(zhì)量、實驗操作等問題會導致“假陰性”結果；抗體檢測操作簡單快捷，可作為核酸檢測假陰性的有效補充，但其對靈敏度和特異性要求高，靈敏度低會產(chǎn)生“假陰性”結果，特異性低則會產(chǎn)生“假陽性”結果。分離技術作為新型冠狀病毒檢測的關鍵技術，可分離純化復雜基質(zhì)中病毒顆粒、核酸和蛋白質(zhì)，減少基質(zhì)中干擾物質(zhì)帶來的“假陽性”結果；同時，分離技術與新型檢測技術結合，可進一步提高病毒相關蛋白質(zhì)檢測的靈敏性和特異性，確保檢測結果準確可靠。

綜上所述，分離技術在新型冠狀病毒研究和防疫檢測中應用廣泛。這些分離技術各具特色，根據(jù)實驗需要選用合適的分離技術，靈活組合，能有效推動新型冠狀病毒檢測、疫苗和創(chuàng)新療法的研發(fā)，使疫情早日得到控制。

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