煙堿作為煙葉的特征成分不僅具有調(diào)節(jié)吸食者情緒的作用，而且是廣譜殺菌劑和殺蟲劑。隨著檢測技術(shù)的進步，煙堿的檢測方法已從最初的硅鎢酸重量法，發(fā)展到后來的紫外分光光度法、連續(xù)流動分析法、氣相色譜法(GC、GC-MS)、液相色譜法(HPLC)等。每種方法都有其適合的應(yīng)用場景、需求和價值，也各具優(yōu)缺點，如連續(xù)流動分析法、GC-MS、HPLC法檢測精確度高，但是儀器較為昂貴；硅鎢酸重量法設(shè)備簡單但操作繁瑣、步驟多且精確度較低。而紫外分光光度法操作較為簡單，設(shè)備便宜，精確度較高，廣泛應(yīng)用于教學和實踐中。

1977年原輕工業(yè)部煙草所推薦了用紫外分光光度法測煙堿。1982年王秀芝等在此基礎(chǔ)上補充了待測液的最適濃度、萃取時間等，并且修訂了檢測煙堿的計算公式；同年，孫瑞申等又進行了細化和完善。前輩們得出的最重要的結(jié)論是驗證和完善了煙堿含量計算公式，即

細讀前輩們的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)使用該公式的前提和相關(guān)注意事項有：1) 原公式是以硅鎢酸重量法檢測結(jié)果為標準制定，1.059是與該方法對比后的校正系數(shù)；2) 處理方法為蒸餾法，即把樣品、水、氯化鈉、氫氧化鈉一起放入燒瓶中加熱蒸餾，餾分經(jīng)硫酸吸收后進行檢測；3) 溶液吸光度在0.167～0.651，其對應(yīng)煙堿濃度為5～18 mg/L；4) 原公式的提出是基于假設(shè)雜質(zhì)對煙堿在259 nm處吸光度的干擾等于236 nm和282 nm處干擾形成梯形的中位線。

在教學和實踐應(yīng)用中，該公式應(yīng)用較廣，但也存在一些瑕疵：1) 原公式的樣品處理方法為蒸餾法，而該方法操作繁瑣，因此在一些實際應(yīng)用時很容易被忽視而采用溶劑萃取法，不同的處理方法其雜質(zhì)差異較大，原公式在此適用性存疑；2) 校正系數(shù)1.059以硅鎢酸重量法為基準，現(xiàn)今可采用更精確的高效液相色譜法；3) 原公式以烤煙為原料，對其它類型煙葉的適用性未知。因此，該研究以高效液相色譜法檢測結(jié)果為基準，采用更常用的溶劑萃取法進行前處理，分別以4種不同類型煙葉即烤煙、白肋煙、雪茄煙、曬煙為對象嘗試對該公式進行完善，以便為應(yīng)用者提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

烤煙(54個，產(chǎn)地云南、河南、江西、貴州、重慶)、曬紅煙(4個，產(chǎn)地吉林)、白肋煙(4個，產(chǎn)地湖北)和雪茄煙(15個，產(chǎn)地海南、四川)，共計77個。

煙堿(加拿大，TRC)；醋酸鈉、磷酸、三乙胺、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇(分析純，天津大茂)；乙腈、甲醇(色譜純，天津科密歐)。

電子天平(上海上平，精度0.000 1 g)，超聲儀(鄭州生元，SYU-10-300 DT)，pH計(上海豐控，F(xiàn)K-PH10)，液相色譜(日本島津，LC-20 A)，紫外可見分光光度計(上海元析，UV-5200)。

1.2 樣品紫外掃描

用紫外分光光度計對煙堿(乙腈溶解)、乙醇、甲醇、煙樣(5%甲醇萃取)在210 ～360 nm進行掃描。

配制不同濃度煙堿溶液，在259 nm處考察吸光度線性范圍。

1.3 萃取溶劑對煙堿的影響

稱取100 mg粉碎后過40目篩的煙葉樣品(以下簡稱樣品)，放入錐形瓶中，分別加入不同濃度的鹽酸、氫氧化鈉、氨水、甲醇的水溶液20 mL，震蕩萃取30 min， 用磷酸或三乙胺溶液調(diào)節(jié)pH值至5左右(甲醇萃取液無須調(diào)節(jié)pH值)，過濾至50 mL容量瓶中，定容，用于HPLC檢測。

1.4 萃取時間對煙堿的影響

稱取100 mg樣品，放入錐形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分別萃取10、15、20、25和30 min， 過濾至50 mL容量瓶中，定容，用于HPLC檢測。

1.5 紫外分光光度法檢測

稱取100 mg樣品，加20 mL 5%甲醇萃取30 min， 過濾至50 mL容量瓶定容后得到樣品溶液。樣品溶液分成2份，1份用于液相色譜檢測，1份稀釋20倍后以水為對照用分光光度計進行檢測，檢測波長分別為236、240、260、282 nm。

1.6 液相色譜法檢測

配制不同濃度煙堿標品溶液，用于繪制標準曲線。

色譜條件：島津Shim pack GIST C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流動相A(90%甲醇+10%水，0.1%醋酸鈉，pH值6.8)，流動相B(90%水+10%甲醇，10 ppm磷酸，pH值3.8)，流動相B占4.5%，流速1.0 mL/min， 柱溫35 ℃，進樣量20 μL。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用外標法進行定性和定量檢測，數(shù)據(jù)用Excel 2016和SPSS 19.0進行分析，用origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的紫外掃描

由圖1可知，煙堿最強吸收峰在259 nm處，谷底在236 nm處，大于282 nm后無吸收。而乙醇在小于268 nm時具有紫外吸收，因此，不能用含乙醇溶劑進行萃取后用紫外分光光度計檢測煙堿含量。甲醇在大于240 nm時幾乎無紫外吸收，因此，可以用作萃取溶劑。對5%甲醇水溶液作為萃取劑得到的4種類型煙葉的萃取液進行掃描后發(fā)現(xiàn)，各萃取液均在259 nm處有最強吸收。并且這4種樣品溶液的谷底均在240～242 nm， 大于煙堿的谷底所處波長236 nm。雪茄煙、白肋煙和曬紅煙樣品溶液的吸收曲線走勢較為一致，在大于276 nm后雪茄煙、白肋煙和曬紅煙溶液的吸光度均呈現(xiàn)緩慢下降走勢，而烤煙溶液吸光度在276～328 nm內(nèi)下降趨勢不明顯。

由表1可以看出，紫外吸收峰谷比值差異非常大，煙堿達到3.27，烤煙最小，為1.02，而3種晾曬煙比值較為接近，為1.22～1.27。

由圖2a、b可知，在煙堿濃度小于0.909 μg/mL(吸光度為0.047)和濃度大于128.424 μg/mL(吸光度2.088)，曲線有偏離趨勢。在中濃度范圍2.056(吸光度0.074)～116.080 μg/mL(吸光度1.935)其線性關(guān)系較好，R2為0.999 2，遠遠好于前人研究結(jié)果中的線性范圍0.167～0.671和0.2～0.8，線性范圍的大幅擴展說明現(xiàn)今的紫外分光光度計性能有大幅提升。

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