北方偉業(yè)計(jì)量集團(tuán)有限公司
從培養(yǎng)基中隨機(jī)挑選白色、網(wǎng)形的凸起菌落，經(jīng)過氧化氫酶和革蘭氏染色試驗(yàn)后，選出過氧化氫酶陰性、革蘭氏測(cè)序，經(jīng)同源序列比對(duì)后，共鑒定出4株干酪乳桿菌和2株糞腸球菌。由圖1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可以看出，共檢測(cè)到2個(gè)屬：腸球菌屬和乳桿菌屬。MMl(干酪乳桿菌)、MM6(干酪乳桿菌)、MM8(副干酪乳桿菌)、MM9(干酪乳桿菌)和YLl(屎腸球菌)、YM2(屎腸球菌)形成了2個(gè)類群并與對(duì)應(yīng)的模式菌株聚在一起，進(jìn)一步驗(yàn)證了分子學(xué)鑒定結(jié)果的可靠性。
選擇與模式菌株親緣關(guān)系最近的MM6菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。如圖2所示，干酪乳桿菌MM6在2～14h處于指數(shù)生長(zhǎng)期，在14～20h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，20h以后由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足和代謝物的積累，菌體死亡數(shù)量增多。試驗(yàn)收集指數(shù)生長(zhǎng)后期菌體進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，此時(shí)菌株生長(zhǎng)旺盛，酶等代謝相關(guān)物質(zhì)活性較高。通過倒平板記取菌落數(shù)，得到其與0D600nm值的對(duì)應(yīng)關(guān)系(圖2b)，縱坐標(biāo)為稀釋106后的菌落數(shù)，雙蒸水重懸浮菌泥至相應(yīng)0D600nm值以保證發(fā)酵面團(tuán)中活菌體的含量為108CFU/g。
如圖3所示，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，空白組(K)pH值和TTA值變化不大，然而干酪乳桿菌添加組(LAB)的pH值逐漸降低，24h后低至3.9，TTA值與pH值變化呈相反的趨勢(shì)。干酪乳桿菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，發(fā)酵過程中乳酸、醋酸等有機(jī)酸的代謝導(dǎo)致面團(tuán)pH值下降、TTA值增加。
采用SDS-PAGE試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵過程中面團(tuán)蛋白的變化進(jìn)行了評(píng)估。如圖4所示，在發(fā)酵24h后，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的組分和含量均有變化。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，清、球蛋白中25～35，15～25，10～15ku條帶變淺：醇溶蛋白條帶無明顯變化：谷蛋白80ku和40ku左右的條帶發(fā)酵后明顯變淺。12，15～25，40.88ku區(qū)域分別對(duì)應(yīng)著小麥過敏原Tria37.Tria18，Tria36和Tria26，從圖4可以看出，這些區(qū)域的蛋白在發(fā)酵24h后均有一定程度的降解。
圖5顯示，發(fā)酵后的大部分蛋白樣品仍與抗小麥蛋白兔血清發(fā)生了較為強(qiáng)烈的反應(yīng)。清蛋白和球蛋白中12ku和15～25ku區(qū)域的Tria37和Tria18含量大大降低，與抗體結(jié)合反應(yīng)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱。醇溶蛋白和谷蛋白在25～30ku區(qū)域內(nèi)逐漸出現(xiàn)了新的免疫結(jié)合條帶，說明一些免疫肽段可被降解成更小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，但是仍具有抗原性，可能是由于過敏原線性表位仍未被破環(huán)。發(fā)酵過程中面團(tuán)蛋白組分及蛋白抗原性變化表明，大部分小麥過敏原難以通過發(fā)酵得到降解，L0ponen等和Ganzle的研究指出.酸面團(tuán)發(fā)酵過程中一部分谷蛋白會(huì)被降解成30ku左右的醇溶蛋白，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符。發(fā)酵是一種緩慢酶解的過程，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸能將面團(tuán)的pH值降至4左右，可激活面團(tuán)中主要的蛋白酶(天冬氨酸蛋白酶)分解大分子蛋白。面粉中的內(nèi)源蛋白酶以及乳酸菌中的肽酶等均能起到水解面團(tuán)蛋白的作用。已有研究表明干酪乳桿菌具有膜蛋白酶，可將體系中的大分子蛋白水解為多肽，膜上的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)會(huì)將多肽轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)，胞內(nèi)肽酶將繼續(xù)水解肽段B181。因此，相比于空白組，添加干酪乳桿菌的面團(tuán)，小麥蛋白被部分水解。
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