一、設(shè)備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:

1.1 冰箱:0℃~4℃。

1.2 恒溫培養(yǎng)箱:26℃±1℃、36℃±1℃。

1.3 顯微鏡:10倍~100倍。

1.4 均質(zhì)器。

1.5 天平:感量0.1g。

1.6 滅菌試管:16mm×160mm、15mm×100mm。

1.7 滅菌吸管:1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。

1.8 錐形瓶:200mL、500mL。

1.9 滅菌平皿:直徑90mm。

1.10 微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統(tǒng)。

二、培養(yǎng)基和試劑

2.1 改良磷酸鹽緩沖液:

2.2 CIN-1培養(yǎng)基(CepulodinIrgasanNovobiocinAgar)

2.3 改良Y培養(yǎng)基(AgarY,Modified)

2.4 改良克氏雙糖培養(yǎng)基。

2.5 糖發(fā)酵管

2.6 鳥氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基。

2.7 半固體瓊脂

2.8 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和V-P試驗用]。

2.9 堿處理液

2.10 尿素培養(yǎng)基

2.11 營養(yǎng)瓊脂

2.12 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌診斷血清。

三、操作步驟

3.1 增菌

以無菌操作取25g(或25mL)樣品放入含有225mL改良磷酸鹽緩沖液增菌液的無菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋內(nèi),以8000r/min均質(zhì)1min或拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min。液體樣品或粉末狀樣品,應(yīng)振蕩混勻。均質(zhì)后于26℃±1℃增菌48h~72h。增菌時間長短可根據(jù)對樣品污染程度的估計來確定。

3.2 堿處理

除乳與乳制品外,其他食品的增菌液0.5mL與堿處理液4.5mL充分混合15s。

3.3 分離

將乳與乳制品增菌液或經(jīng)過堿處理的其他食品增菌液分別接種于CIN-1瓊脂平板和改良Y 瓊脂平板,26℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。典型菌落在CIN-1上為深紅色中心,周圍具有無色透明圈(紅色牛眼狀菌落),菌落大小為1mm~2mm,在改良Y瓊脂平板上為無色透明、不黏稠的菌落。

3.4 改良克氏雙糖試驗

分別挑取5.3中的可疑菌落3個~5個,分別接種于改良克氏雙糖鐵瓊脂,接種時先在斜面劃線,再于底層穿刺,26℃±1℃培養(yǎng)24h,將斜面和底部皆變黃且不產(chǎn)氣的培養(yǎng)物做進一步的生化鑒定。

3.5 尿素酶試驗和動力觀察

用接種環(huán)挑取一滿環(huán)5.4得到的可疑培養(yǎng)物,接種到尿素培養(yǎng)基中,接種量應(yīng)足夠大,振搖幾秒鐘,26℃±1℃培養(yǎng)2h~4h。將尿素酶試驗陽性菌落分別接種于兩管半固體培養(yǎng)基中,于26℃±1℃和36℃±1℃培養(yǎng)24h。將在26℃有動力而36℃無動力的可疑菌培養(yǎng)物劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板,進行純化培養(yǎng),用純化物進行革蘭氏染色鏡檢和生化試驗。

3.6 革蘭氏染色鏡檢

將純化的可疑菌進行革蘭染色。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌呈革蘭氏陰性球桿菌,有時呈橢圓或桿狀,大小為(0.8μm~3.0μm)×0.8μm

3.7 生化鑒定

3.7.1 從5.5中的營養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個菌落接種生化反應(yīng)管,生化反應(yīng)在26℃±1℃進行。

3.7.2 如選擇微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統(tǒng),可根據(jù)5.6鏡檢結(jié)果,選擇革蘭陰性球桿菌菌落作為可疑菌落,從5.5所接種的營養(yǎng)

瓊脂平板上挑取單菌落,使用微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

3.8 血清型鑒定

除進行生化鑒定外,可選擇做血清型鑒定。在潔凈的載玻片上加一滴O 因子血清,將待試培養(yǎng)物混入其內(nèi),使成為均一性混濁懸液,將玻片輕輕搖動0.5min~1min,在黑色背景下觀察反應(yīng)。如在2min內(nèi)出現(xiàn)比較明顯的小顆粒狀凝集者,即為陽性反應(yīng),反之則為陰性,另用生理鹽水作對照試驗,以檢查有無自凝現(xiàn)象

四、結(jié)果與報告

綜合以上及生化特征報告結(jié)果,報告25g(或25mL)樣品中檢出或未檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。

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