Copines蛋白家族是一類Ca2+依賴磷脂結合蛋白，分布廣泛且進化保守。該家族成員在結構上具有相同特征:N末端有兩個與已知的Ca2+依賴磷脂結合C2結構域高度相似的C2結構域;C末端有1個與整合蛋白(integrin)胞外區(qū)的A結構域具有同源性的A結構域。目前在哺乳動物中已發(fā)現8個該蛋白家族成員，分別為Copine-1～Copine-8(基因名CPNE1～CPNE8)。

Copine-1蛋白是最先被發(fā)現的。Yoo等通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低Copine-1蛋白表達能夠抑制人骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。研究發(fā)現，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可以上調內源性Copine-1蛋白的表達，且TNF-α信號傳導途徑對毒蕈堿刺激的反應隨著Copine-1表達的增加而增強;Copine-1蛋白還可以增強核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa-B，ⅠκB)的TNF-α依賴性降解。此外，Copine-1蛋白與p65相互作用能夠消除核因子κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)的轉錄。Copine-6蛋白主要在神經元中表達，研究表明，Copine-6蛋白在癲癇腦組織中的異常表達可能與難治性癲癇有重要聯系。Copine-7蛋白是一種成神經細胞衍生因子，能夠調節(jié)間充質干細胞的成牙本質細胞分化和正向調控牙本質唾液磷蛋白表達。Copine-8蛋白可能是一個抑制急性髓性白血病癌細胞增殖的因子。

Copine-3蛋白與Copine-1蛋白的氨基酸序列同源性高達63%，其在人體的腦、肺、心臟、腎臟組織中均有表達。Caudell等發(fā)現，內源性Copine-3蛋白和外源表達的重組Copine-3蛋白均可使外源髓鞘磷脂堿性蛋白磷酸化，然而，Copine-3蛋白氨基酸序列中缺少已知的激酶催化結構域，這些研究提示，Copine-3蛋白可能具有內在的激酶活性。研究發(fā)現，Copine-3蛋白的高表達與急性骨髓性白血病的不良預后有關。Tan等研究發(fā)現，與患有慢性冠狀動脈疾病的患者相比，急性心肌梗死患者的外周血中Copine-3蛋白的表達量更低，表明CPNE3基因的低表達是發(fā)生急性心肌梗死的潛在危險因素。綜上所述，Copine-3蛋白在人體組織中廣泛表達，但其在細胞中的功能尚不明確。

本研究利用增強型綠色熒光蛋白(plasmid enhanced green fluorescent protein,p EGFP)-N1構建重組真核表達載體，脂質體轉染人胚腎上皮細胞293T、肺腺癌細胞H1299，瞬時表達Copine-3-EGFP融合蛋白，觀察并檢測Copine-3蛋白在細胞中的定位，為進一步研究其生物學功能提供基礎。

材料和方法

1．主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)、OptiMEMTMⅠ培養(yǎng)基購自Gibco公司;107IU/L青霉素+10 g/L鏈霉素(雙抗)、0.25%胰蛋白酶細胞消化液購自索萊寶科技有限公司;LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent轉染試劑、Pro LongTM Gold Antifade Mountant with DAPI封片劑、Copine-3抗體(兔抗人Ig G,2.63 g/L)和羅丹明標記的山羊抗兔Ig G二抗(1.5 g/L)購自Invitrogen公司;DNA分子量標準、Prime STAR HS DNA Polymerase、XhoⅠ和Bam HⅠ限制性內切酶以及High Fidelity Prime ScriptTMRT-PCR Kit購自Ta KaRa公司;總RNA提取、質粒提取、DNA純化試劑盒以及T4連接酶購自天根生化科技(北京)有限公司;GAPDH抗體(兔抗人Ig G,1 g/L)、β-acting抗體(兔抗人Ig G,1 g/L)購自Affinity公司;Histone H1抗體(鼠抗人Ig G,200 mg/L,Santa公司);HRP標記的山羊抗兔Ig G二抗(1 g/L)和HRP標記的山羊抗鼠Ig G二抗(1 g/L)購自Bioworld公司;細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;PVDF膜(Bio-Rad公司);引物合成和DNA測序由英濰捷基上海貿易有限公司完成;GTVisionⅢ型免疫組織化學檢測試劑盒購自基因科技(上海)股份有限公司，肺腺癌組織芯片(HLug A030PG03)購自上海芯超生物科技有限公司。

CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司);小型高速冷凍離心機(Eppendorf公司);蛋白電泳儀(Bio-Rad公司);Western轉印儀(Hoefer公司);熒光倒置顯微鏡、激光掃描共焦顯微鏡(Leica公司)。

2. 實驗方法

2.1 細胞總RNA的提取及反轉錄:

人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells,HBE)接種于6孔板中，用含雙抗和10%FBS的DMEM培養(yǎng)至90%匯合。細胞經0.25%胰蛋白酶消化后，500 r/min離心5 min收集。按天根生化科技(北京)有限公司總RNA提取試劑盒(DP419)說明書操作進行細胞總RNA的提取。將提取到的細胞總RNA，按High Fidelity Primer ScriptTMRT-PCR Kit試劑盒說明書操作，反轉錄獲得c DNA。

2.2 人CPNE3基因的擴增:

根據CPNE3基因編碼序列(片段全長1613 bp)，設計合成上游引物5’-A C G T C T C G A G A T G G C T G C C C A G T G T G T C A C AA-3’和下游引物5’-A C G TGGATC C GC C TGC TTC TG T T G T T T C G T G G CT-3’，上、下游引物分別加入XhoⅠ、Bam HⅠ酶切位點(下劃線為酶切位點序列)。以c DNA為模版，PCR擴增CPNE3基因編碼序列，反應條件為:94℃預變性5 min,94℃變性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸2 min，循環(huán)30次，72℃延伸10 min。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，膠回收與目的片段大小相同的DNA條帶。

2.3 重組質粒p EGFP-N1-CPNE3的構建:

將p EGFP-N1質粒和CPNE3基因PCR產物，分別用XhoⅠ和Bam HⅠ，在37℃下酶切1 h，膠回收純化酶切產物，并用T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，利用卡那霉素抗性篩選陽性集落，并抽提質粒進行雙酶切驗證。將篩選到的陽性集落送測序。將測序正確的陽性集落接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，收集菌體，按高純度質粒小提中量試劑盒說明書操作提取質粒，用于后續(xù)細胞轉染。

2.4 重組質粒轉染細胞:

293T和H1299細胞常規(guī)培養(yǎng)于含雙抗和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，消化并接種6孔板。待細胞生長至60%匯合時，按LipofectamineLTX with PlusTMReagent轉染說明，進行p EGFP-N1質粒和p EGFP-N1-CPNE3重組質粒的轉染。

2.5 細胞爬片:

293T和H1299細胞常規(guī)培養(yǎng)于含雙抗和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，消化并接種于放有細胞爬片的24孔板中。待細胞生長至60%匯合時，按LTX with PlusTMReagent轉染說明，進行p EGFP-N1-CPNE3重組質粒的轉染，對照組為p EGFP-N1質粒。

2.6 激光掃描共焦檢測:

在2.5中細胞轉染48 h后，吸除培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次，加入4%多聚甲醛固定10 min,0.2%Triton-100透化10 min。10%羊血清室溫封閉1 h。GAPDH抗體用2%羊血清按1∶100稀釋，滴加于爬片上，4℃孵育過夜。PBST漂洗爬片3次，每次5 min。羅丹明標記的熒光二抗(1∶100)室溫避光孵育2 h,PBST漂洗3次。在載玻片上滴加含DAPI的封片劑，將爬片反扣在封片劑上，用中性樹脂在爬片四周經行封固。選擇405nm激發(fā)光檢測DAPI,488 nm激發(fā)光檢測EGFP和Copine-3-EGFP融合蛋白，552 nm激發(fā)光檢測GAPDH。在激光掃描共焦顯微鏡下觀察并攝片。

2.7亞細胞組分離:

在2.4中細胞轉染48 h后，用PBS清洗兩次，0.25%胰蛋白酶消化并離心收集細胞。使用上海碧云天生物技術有限公司的細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒，對細胞亞組份進行分離。步驟:向收集的細胞中加入200μl細胞質蛋白抽提試劑A，劇烈渦旋使細胞完全散開，冰浴15 min。加入10μl抽提試劑B，渦旋混勻5 s，冰浴1 min，再次渦旋5 s。4℃，12 000 r/min離心15 min。將上清液轉移到新的EP管中，得到胞質蛋白。向沉淀中加入50μl細胞核蛋白抽提試劑，渦旋混勻30 s，冰浴30 min，期間每隔1～2 min渦旋混勻30 s。4℃，12 000 r/min離心15 min，轉移上清液到新的EP管中，得到細胞核蛋白。Bradford法測定蛋白濃度，用于后續(xù)Western blotting檢測。

2.8 Western blotting檢測:

分別取40μg胞質蛋白和細胞核蛋白經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，100 V恒壓濕轉1 h至0.2μm PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,PBST(含0.5%吐溫20的PBS溶液)洗膜3次。加入Copine-3抗體(1∶1000),4℃孵育過夜，PBST洗膜3次，每次8 min。加入HRP標記的羊抗兔Ig G二抗(1∶3000)，室溫孵育1.5 h,PBST洗膜3次，每次8 min。向PVDF膜上均勻滴加ECL發(fā)光液，于暗房內顯影。

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