2.3 超濾提純條件優(yōu)化設(shè)計(jì)

將上述優(yōu)化條件制得酶液做進(jìn)一步超濾提純優(yōu)化，將酶液置于截留量為50ku的超濾離心管中，于4000～6000×g，離心5～15min，除去雜蛋白，棄去離心管上層液。再將下層液置于截留量為3ku的超濾離心管中，于6500×g，離心20min，保留上層截留液，測(cè)定其酶含量及比活力，結(jié)果如表5所示?？芍?，隨著轉(zhuǎn)速的升高，酶含量逐漸升高，而溶菌酶比活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，推測(cè)由于離心轉(zhuǎn)速過(guò)低使得溶菌酶被部分截留在上層，而離心轉(zhuǎn)速過(guò)高，雖能將溶菌酶全部透過(guò)下層，但部分雜蛋白不能有效去除，同樣不被截留，或是溶菌酶在高速離心過(guò)程中有所損傷，致酶活力下降。且隨著離心時(shí)間延長(zhǎng)，比活力有所增加，然而離心時(shí)間不適宜過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)的離心時(shí)間會(huì)使效率降低，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。故當(dāng)溶菌酶比活力為最大值時(shí)，選擇50ku超濾離心管，在5000×g條件下離心10min。

2.4 溶菌酶純度檢驗(yàn)

將最優(yōu)陽(yáng)離子交換法所得的洗脫液與最優(yōu)的超濾液分別取樣進(jìn)行ＳDＳ-PAGE凝膠電泳試驗(yàn)，電泳結(jié)果如圖8和圖9所示。

由圖8、圖9對(duì)比可知，洗脫液和超濾液均可在14.4ku看見(jiàn)明顯條帶，與蛋清溶菌酶的相對(duì)分子質(zhì)量相符。此外，只經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換法的洗脫液的雜蛋白及雜質(zhì)鹽較多，影響純度，而洗脫液經(jīng)過(guò)二步超濾后，雜蛋白、雜質(zhì)鹽較少，提取的溶菌酶純度較高。

選用經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換法協(xié)同二步超濾法提純的蛋清溶菌酶液，測(cè)定溶菌酶的純度，結(jié)果如圖10所示，并用ＩmageLab5.2.1軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)如表6所示。

由表6可知，超濾液中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在14.4～15.1ku，符合蛋清溶菌酶分子質(zhì)量的分布范圍。除泳道4外，其余泳道平均值為2290619，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的第6條帶（溶菌酶條帶）含量為0.125μg/μL，上樣量為5μL，相對(duì)濃度值為619080，試驗(yàn)測(cè)得超濾液中蛋白質(zhì)含量為2.40μg/μL，上樣量10μL（上樣緩沖液∶樣品（體積比）=4∶1），相對(duì)濃度值為2290619，故估算得溶菌酶純度為96.36%，測(cè)得該溶菌酶的比活力為23718.61U/mg。

2.5 溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)探究

2.5.1 pH值對(duì)溶菌酶酶活的影響

由圖11可知，隨pH值的不斷升高，溶菌酶的相對(duì)酶活呈先上升后下降的趨勢(shì)，溶菌酶在pH5～8均可保持85%以上的相對(duì)酶活，在pH值為3～4時(shí)仍有70%以上的相對(duì)酶活，在pH值為7.0時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，可推測(cè)，溶菌酶的最適pH值約為7.0。pH值影響溶菌酶酶活的原因可能是由于pH值的改變對(duì)底物溶壁微球菌的狀態(tài)產(chǎn)生影響，也可能是pH值使得酶的帶電狀態(tài)改變，從而影響酶的活性。

2.5.2 溫度對(duì)溶菌酶酶活的影響

由圖12可知，在20～60℃時(shí)，溶菌酶相對(duì)酶活隨溫度升高緩慢上升，且相對(duì)酶活均在78%以上，溫度作用范圍廣；在60℃時(shí)，酶活達(dá)到最高值，若繼續(xù)升溫，則酶活下降較快。其可能是因?yàn)榈蜏貢r(shí)隨溫度上升分子運(yùn)動(dòng)加快，提高了反應(yīng)速度，而當(dāng)溫度到達(dá)60℃后，隨反應(yīng)溫度的升高，蛋清溶菌酶逐漸失活，使得酶活性下降。

2.5.3 溶菌酶的pH穩(wěn)定性

由圖13可知，溶菌酶在偏酸及中性的環(huán)境下比較穩(wěn)定，在pH4.0～7.0的范圍內(nèi)，相對(duì)酶活保持在88%以上。而在堿性環(huán)境下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，相對(duì)酶活逐漸下降，且隨pH值升高，變化幅度越來(lái)越大，在pH8.0的生理鹽水中處理90min，酶活力降為初始的80%，而在pH9.0的生理鹽水中處理90min，酶活力降為初始的65%。故溶菌酶在偏酸性及中性條件下較為穩(wěn)定，而過(guò)酸、過(guò)堿易使其失活，這與傅婷等的研究結(jié)果類似，可能是由于溶菌酶在酸性環(huán)境中其主鏈構(gòu)象隨酸度變化影響不大，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。

2.5.4 溶菌酶的溫度穩(wěn)定性

由圖14可知，在30～60℃時(shí)，溫度對(duì)酶活影響不大，溶菌酶保持較高穩(wěn)定性；在70℃保溫一段時(shí)間，酶活緩慢下降，90min后，比活力降低為初始值的78%；而在80℃保溫一段時(shí)間，酶活下降速率較高，90min后，比活力降為初始值的52%。可能是隨溫度升高，溶菌酶變性失活程度升高，失活速度加快。

2.5.5 金屬離子對(duì)溶菌酶酶活的影響

由圖15可知，Na⁺、Ca²⁺對(duì)溶菌酶有較強(qiáng)的激活作用；K⁺對(duì)溶菌酶激活作用較弱；而Zn²⁺對(duì)溶菌酶活性有較強(qiáng)的抑制作用；其它金屬離子（Mg²⁺、Mn²⁺）對(duì)溶菌酶活性無(wú)明顯影響。故除少數(shù)離子對(duì)溶菌酶活性有抑制作用外，大部分金屬離子對(duì)酶活不會(huì)產(chǎn)生影響或起到激活作用，即大部分金屬離子與溶菌酶具有良好的配伍作用。

2.5.6 表面活性劑對(duì)溶菌酶酶活的影響

由圖16可知，幾種表面活性劑對(duì)蛋清溶菌酶活性都有一定的抑制作用，其中Tween20、Tween40、Tween80對(duì)酶活力影響較小，相對(duì)酶活力保持在84%以上，而經(jīng)過(guò)體積分?jǐn)?shù)10%的甘油處理的溶菌酶相對(duì)酶活力降至78%。這可能與表面活性劑對(duì)溶菌酶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響有關(guān)；表面活性劑的高黏度特性會(huì)降低溶菌酶的活性，因而在溶菌酶制備過(guò)程中應(yīng)減少或不使用表面活性劑。

3 結(jié)論

本文對(duì)陽(yáng)離子交換法協(xié)同超濾技術(shù)提取蛋清中溶菌酶的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)溶菌酶的純度和部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究，主要結(jié)論如下：

1）基于單因素和Box-Behnken試驗(yàn)得到最優(yōu)提取工藝條件為：樹(shù)脂用量為蛋清濾液體積為24.2%，洗脫液為1.00mol/LNaCl，蛋清濾液pH值為9.10，洗脫時(shí)間為62.61min，此時(shí)理論預(yù)測(cè)酶液的比活力為21041.1U/mg。對(duì)所獲得的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證得到實(shí)際酶液的比活力為20509.58U/mg。將優(yōu)化后的酶液進(jìn)行超濾優(yōu)化，并進(jìn)行SDS-PAGE純度鑒定，所得二步超濾條件為：使用50ku超濾，在5000×g條件下離心10min，再用3ku超濾，6000×g離心20min，最終測(cè)得溶菌酶的比活力為23718.61U/mg，純度為96.36%。

2）通過(guò)對(duì)溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究可知，溶菌酶最適pH值為7.0，pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；最適反應(yīng)溫度為60℃，低溫下熱穩(wěn)定性良好，在較高溫度下酶活下降較快；Na⁺、Ca²⁺對(duì)酶有較強(qiáng)激活作用，K⁺有一定激活作用，Mg²⁺、Mn²⁺對(duì)酶活影響不大，Zn²⁺對(duì)酶有明顯抑制作用；表面活性劑甘油、Tween20、Tween40、Tween80均對(duì)溶菌酶有抑制作用，甘油的抑制作用較強(qiáng)。

本文通過(guò)單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化陽(yáng)離子交換法-超濾法協(xié)同提取蛋清中溶菌酶最佳的工藝條件，并對(duì)所提取溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究，為下一步工業(yè)化及規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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